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miR-149-5p抑制肝癌侵袭转移的实验研究

作　者: 曹亚玲
导　师: 杨仕明; 刘祥德
学　校: 第三军医大学
专　业: 内科学
关键词: 肝癌肝细胞癌侵袭转移 miR-149-5p miR-149 SP1
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

[背景和目的]作为20世纪末生命科学领域的重大发现，微小RNA（microRNA, miRNA）已迅速成为了多个学科的研究热点。研究表明，这种保守的、非编码的、内源性单链小RNA分子，通过与靶mRNA特定序列的结合调控基因的表达，在肿瘤发生和转移的过程中起着起着癌基因（oncomiRNAs）或抑癌基因（tumor suppressor miRNAs）的作用。在世界上肝癌发病率最高的国家中，我国即为其一，每年大约有11万例患者因肝癌而死亡。其中，肝细胞癌（以下简称肝癌, hepatocellular carcinoma, HCC）又在原发性肝癌中占85-90%，为其最多见的组织学分型。肝癌预后差，肝癌转移是影响肝癌患者疗效和获得长期生存的关键问题，其确切的机制仍不清楚，现仍缺乏早期诊断和有效治疗的方法。虽然目前医学已经取得极大进步，但其5年生存率仍很低，复发和转移常见。因此，通过研究miRNA在肝癌中的作用，可进一步阐明肝癌发生发展的内在机制，从而为肝癌的诊治提供新的思路。本研究即从在肝癌中表达失调的miRNA入手，探索肝癌发生发展的机制。[方法]1.采用miRNA基因芯片技术筛选可能参与调控肝癌转移的miRNA；2.采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chainreaction, qRT-PCR）在不同转移潜能肝癌细胞株中验证肝癌转移相关miRNA；3.采用qRT-PCR技术验证肝癌转移相关miRNA在肝癌及非肝癌患者血浆中的表达；4.采用qRT-PCR技术验证肝癌转移相关miRNA在手术标本（肝癌和癌旁肝组织）中的表达；5.分析miRNA与肝癌临床病理特征、临床预后的关系。6.采用qRT-PCR技术验证肝癌转移相关miRNA在不同肝癌细胞株及肝癌和癌旁肝组织细胞中的表达；7.采用慢病毒感染技术过表达肝癌细胞内miRNA的表达水平；8.采用MTT实验、流式细胞术、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell侵袭实验对肝癌转移相关miRNA进行功能分析，观察该miRNA在体外实验中对肝癌细胞株的生物学行为会产生什么影响；9.采用生物信息学技术预测肝癌转移相关miRNA的靶基因；10.采用Western blot方法初步验证miRNA对靶基因的调控作用；［结果］1.经过miRNA基因芯片技术的初步筛查，我们发现：22条miRNA在高转移肝癌细胞株中表达上调超过2倍或以上，2条miRNA在高转移肝癌细胞株中表达下调超过2倍或以上，进一步qRT-PCR检测发现miR-149-5（p原名miR-149）、miR-345、miR-193b*、miR-1301等4条miRNA在高、低转移潜能肝癌细胞株中表达差异超过3倍，差异最为明显的是miR-149-5p；2.通过qRT-PCR方法检测miR-149-5p在肝癌伴（26例）或不伴转移（14例）、肝硬化（3例）、转移性肝癌患者（6例）及正常人（30例）血浆中的含量，发现血浆miR-149-5p对于肝癌的诊断和鉴别诊断无明显统计学意义（p<0.05）；3.通过qRT-PCR方法检测95对手术标本（肝癌和癌旁肝组织）中miR-149-5p的表达，发现miR-149-5p在癌组织中的相对含量显著低于癌旁肝组织（6.982±1.166vs.12.208±2.461, p<0.05）；4.进一步分析miR-149-5p在95例肝癌和癌旁肝组织中相对含量的比值（C/P）与性别、年龄、肝炎、AFP、肝硬化、肿瘤大小、多少、分化、分期及淋巴结转移的关系，发现：C/P比值与肝硬化病史显著相关（p<0.05）；与AFP含量和淋巴结转移负相关，但无统计学差异（p>0.05），可能与相应分组样本量偏少有关；同时，生存曲线分析表明，C/P>1组患者术后生存时间优于C/P<1组，但无统计学差异（p>0.05），可能与随访时间过短有关；5.通过qRT-PCR方法检测MHCC97-H、MHCC97-L、Huh-7、SMMC-7721、HepG2、PLC、LO2细胞株与肝癌和癌旁肝组织细胞中miR-149-5p的表达，发现miR-149-5p在各细胞株及癌组织细胞中的表达低于癌旁肝组织细胞（p<0.01）；6.通过负载miR-149-5p的慢病毒成功感染MHCC97-H细胞后，MTT实验表明miR-149-5p过表达可明显抑制MHCC97-H细胞的增殖能力（p<0.01），流式细胞术表明miR-149-5p对MHCC97-H的细胞周期无明显影响，平板克隆形成实验表明miR-149-5p过表达可抑制MHCC97-H细胞克隆形成能力（克隆形成率：0.137±0.013vs.0.263±0.018,0.256±0.002, p<0.05），划痕实验表明miR-149-5p过表达可抑制MHCC97-H细胞体外迁移能力（24h划痕宽度/0h划痕宽度：0.643±0.036vs.0.454±0.037,0.469±0.013, p<0.05），Transwell侵袭实验表明miR-149-5p过表达可抑制MHCC97-H细胞体外侵袭能力（透膜细胞数：（71.7±7.3）/视野vs.（133.2±4.5）/视野,（122.3±3.4）/视野, p<0.01）；7.生物信息学预测miR-149-5p可能调控的靶基因有67个，其中与肿瘤转移密切相关的基因为转录因子特异性蛋白1（specificity protein1, SP1），WB技术初步验证SP1可能是miR-149-5p的靶基因之一。［结论］我们首次发现miR-149-5p（原名miR-149）在肝癌组织中表达降低，与肝癌患者的预后密切相关，miR-149-5p过表达可以明显抑制肝癌细胞体外的侵袭转移能力，进一步研究发现，miR-149-5p可能通过调控其潜在靶基因SP1的表达来抑制肝癌细胞的侵袭转移。本课题从miRNA水平初步阐明了肝癌转移的新机制，为肝癌的诊治及预后的判断提供了新的靶标。

全文目录

中英文缩写对照  4-6
英文摘要  6-10
中文摘要  10-13
前言  13-16
第一部分肝癌转移相关miRNA的筛选与验证：miR-149-5p 是癌基因还是抑癌基因？  16-33
  材料与方法  17-22
  结果  22-29
  讨论  29-31
  小结  31-33
第二部分 miR-149-5p对肝癌细胞生物学行为的影响  33-46
  材料与方法  33-37
  结果  37-44
  讨论  44-45
  小结  45-46
第三部分 miR-149-5p抑制肝癌侵袭转移机制的初步研究  46-54
  材料与方法  46-51
  结果  51-52
  讨论  52-53
  小结  53-54
全文结论  54-55
不足之处  55-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
文献综述肝癌相关MicroRNA的研究进展  62-84
  参考文献  72-84
攻读硕士学位期间发表的论文  84

miR-149-5p抑制肝癌侵袭转移的实验研究

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