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HMGB1在原发性肝细胞癌中的表达及其对肝癌细胞HCCLM3增殖和侵袭的影响

作 者: 姜炜
导 师: 王志明
学 校: 中南大学
专 业: 外科学
关键词: 高迁移率族蛋白1 肝细胞癌 增殖 侵袭 NF-κB/p65
分类号: R735.7
类 型: 博士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC),是我国最常见的恶性肿瘤之一,在各种恶性肿瘤的死亡率中位居第二。高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1)作为一种非组蛋白核蛋白被发现在多种肿瘤中高表达,但它在肝癌中所扮演的角色目前并不清楚。在本次研究中,我们检测肝癌组织中HMGB1的表达情况,并分析HMGB1mRNA和肝癌临床病理因素之间的关系;探讨RNA干扰对人肝癌细胞株HCCLM3生物学活性的影响,并初步研究其可能的下游作用机制。方法:(1)收集11例正常肝脏组织、32例肝癌组织及其配对的癌旁组织,逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和Western-blot分析HMGB1的表达水平,免疫组织化学法检测HMGB1的定位,并分析HMGB1mRNA表达水平和肝癌临床病理因素之间的关系。(2)设计并合成了3对特异性针对HMGB1的小干扰RNA序列(HMGB1-siRNA-1、HMGB1-siRNA-2和HMGB1-siRNA-3),通过脂质体LipofectamineTM2000转染HCCLM3细胞,同时设置阴性对照组和空白对照组。实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western-blot检测HMGB1干扰序列对HMGB1表达的影响;MTT法检测细胞的增殖并绘制生长曲线;流式细胞术检测细胞的凋亡;Transwell法检测细胞迁移和侵袭的能力。(3)Real-time PCR和Western-blot检测HMGB1干扰序列转染进入HCCLM3细胞后NF-KB/p65和VEGF-C的表达水平,间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence)检测NF-κB/p65的定位,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测NF-KB/p65的活性。结果:(1)RT-PCR结果表明HMGB1mRNA的相对表达量在肝癌组织中最高,为0.859±0.159,明显高于癌旁组织的0.506±0.131和正常肝脏组织的0.413±0.086(P<0.001)。HMGB1mRNA的过表达与肝癌的TNM分期、Edmondson分级、血管侵犯和包膜侵犯密切相关。Western-blot结果显示HMGB1蛋白在肝癌组织中的表达也是三组中最高的。相关性分析表明,组织中的HMGB1mRNA与HMGB1蛋白表达呈明显正相关(R=0.833,P<0.01)。此外,免疫组化结果显示HMGB1在肝癌中过表达,免疫染色颗粒主要位于细胞核,正常肝脏组织中未见染色,在癌旁组织中有少量染色位于细胞浆。(2) Real-timePCR和Western-blot结果表明,3条特异性针对HMGB1的小干扰RNA序列都可以抑制HMGB1的表达,其中以HMGB1-siRNA-1抑制效率最高。MTT结果显示HMGB1-siRNA-1组细胞的生长速度明显低于阴性对照组和空白对照组(P<0.01);流式细胞术显示HMGB1-siRNA-1组细胞凋亡显著增加(P<0.01);Transwell法结果表明在HMGB1表达抑制的HMGB1-siRNA-1组细胞中,细胞迁移和侵袭的能力较阴性对照组和空白对照组明显下降(P<0.01)。(3)Real-time PCR和Western-blot结果表明,HCCLM3细胞转染HMGB1-siRNA-1后NF-KB/p65和VEGF-C的表达较阴性对照组和空白对照组明显下降(P<0.01);间接免疫荧光法结果显示HMGB1-siRNA-1组的NF-κB/P65核转位减少;ELISA结果显示HMGB1-siRNA-1组的NF-κB/P65活性降低。结论:(1)肝癌组织中HMGB1的表达明显升高;肝癌组织中的HMGB1表达水平与肝癌的TNM分期、Edmondson分级、血管侵犯、包膜侵犯正相关,其过表达可能与肝癌的发生、发展密切相关。(2)特异性针对HMGB1的siRNA序列可以有效地抑制HCCLM3细胞的增殖,促进细胞凋亡,同时抑制HCCLM3细胞迁移和侵袭的能力,HMGB1可能作为肝癌治疗的一个潜在靶点。(3)HMGB1表达抑制后,HCCLM3细胞中NF-KB/p65和VEGF-C的表达均降低,同时可以抑制HCCLM3细胞中NF-KB/p65的核转位并降低其活性,HMGB1可能通过NF-κB信号通路调节VEGF-C的表达。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-13
英汉縮略词对照表  13-16
前言  16-19
第一章 HMGB1在原发性肝细胞癌中的表达及临床意义  19-41
  1.1 材料与方法  20-31
    1.1.1 临床标本的选择和采集  20
    1.1.2 临床病理因素  20-21
    1.1.3 实验的主要试剂和材料  21-22
    1.1.4 实验的主要仪器  22
    1.1.5 实验方法  22-31
  1.2 实验结果  31-39
    1.2.1 RT-PCR结果  31-33
    1.2.2 Western-blot检测组织中HMGB1蛋白的表达  33-34
    1.2.3 HMGB1 mRNA的表达水平与肝癌临床病理因素之间的关系  34-36
    1.2.4 组织的HE染色  36-38
    1.2.5 免疫组化检测检测HMGB1蛋白的表达及定位  38-39
  1.3 讨论  39-40
  1.4 结论  40-41
第二章 特异性RNA干扰人肝癌细胞株HCCLM3细胞中HMGB1的表达对细胞生物学行为的影响  41-65
  2.1 材料与方法  42-53
    2.1.1 细胞株  42-43
    2.1.2 实验的主要试剂和材料  43-44
    2.1.3 实验的主要仪器  44
    2.1.4 实验方法  44-53
  2.2 结果  53-60
    2.2.1 FAM标记的siRNA的转染效率  53-54
    2.2.2 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞中HMGB1 mRNA表达的影响  54-56
    2.2.3 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞中HMGB1蛋白表达的影响  56-58
    2.2.4 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞增殖的影响  58-59
    2.2.5 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞迁移和侵袭能力的影响  59-60
    2.2.6 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞的细胞凋亡的影响  60
  2.3 讨论  60-63
  2.4 结论  63-65
第三章 RNA抑制HMGB1基因表达后下游信号通路的初步研究  65-78
  3.1 材料与方法  66-71
    3.1.1 细胞株  66
    3.1.2 实验的主要试剂和材料  66-67
    3.1.3 实验的主要仪器  67
    3.1.4 实验方法  67-71
  3.2. 结果  71-76
    3.2.1 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞中NF-κB/p65和VEGF-C mRNA表达的影响  71-73
    3.2.2 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞的NF-κB/p65和VEGF-C蛋白表达的影响  73-74
    3.2.3 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞的NF-κB/p65定位的影响  74-75
    3.2.4 RNAi HMGB1对HCCLM3细胞的NF-κB/p65活性的影响  75-76
  3.3 讨论  76-77
  3.4 结论  77-78
总结论  78-79
参考文献  79-88
综述  88-114
  参考文献  103-114
致谢  114-115
攻读学位期间发表的文章  115

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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