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银草合剂对荷肺癌细胞小鼠恶病质影响的实验研究

作　者: 姚文祥
导　师: 陈沛泉
学　校: 广州中医药大学
专　业: 中医临床基础
关键词: 银草合剂肺癌恶病质荧光酵素原位细胞因子
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肺癌在世界各地,无论男性或女性,都是发病率、死亡率高的恶性肿瘤之一,造成各国医疗、经济的重大损失,目前西药虽有药物来治疗肺肿瘤,但副作用相当的大,因此,发现与找出有效治疗肺癌药物,降低毒副作用,为刻不容缓的工作。经由中草药对荷瘤肺癌细胞小鼠的实验研究,观察中草药对荷瘤小鼠恶病质的影响,以期提供癌症治疗策略及新药开发的另一可能途径及方向。依据研究癌症病人有87%会有恶病质的症状,有22%病人死于恶病质而非肿瘤本身。所以了解原因,提供有效的措施来预防和治疗癌症恶病质在癌症病房是重要的一环。恶病质是中晚期腫瘤癌症患者常见的综合证状,尤其是接受过放疗、化疗的患者的表现更为明显。临床表现为倦怠、无力、消化功能障碍、体重减轻、贫血及机体功能衰弱,甚至直接影窖患者生命。因此,如何改善患者的恶病质状态,提升患者的生活品质,已成为临床工作及研究学者急待解决的问题。临床显示中药对增加和稳定体重、改善食欲以及活动能力指数的提高具有相当疗效,透过清热解毒、益气养血、健脾和胃等祛邪、扶正固本中药确实可以改善癌症患者的恶病质状态及提高患者的生活品质。虽然中药的使用在我国已有悠久的历史,且其萃取物自古以来即具有多种治疗疾病甚至是抗癌及抗恶病质的关键成份,但目前仍缺乏有效的科学证据以证实其疗效。因此,如何利用此有效成份并辅以建立与其密切相关的动物实验模式,并藉以显现出其有效性与利用性,是我们必须努力追求突破的着力点。目的：傅统动物实验来筛选药物,大都将癌细胞植入皮下,再观察小鼠的生化指标,或其它细胞因子,但此动物模型并无法贴近一般患者的实际情况,故我们发展一原位小鼠动物模型方式来进行动物实验模式,以利将来成为筛选抗癌中草药物的利器。清热解毒药,自古为中医抗发炎、抗癌的首选药物,可缓解癌细胞所造成的炎症反应及恶病质状态,因此,本实验在之前的实验基础下,选取金银花、夏枯草、蒲公英组成的银草合剂,来测试银草合剂对肺癌细胞所造成的小鼠恶病质的改善情形,以期能有效开发治疗肺癌的中草药。过去肺癌治疗之动物实验方式为将癌细胞植入于皮下,再用光标尺量肿瘤之大小,但对于一些原位癌细胞之生长情形却无法收集其生长曲线之数据,然而最近发展出一套活体影像系统,利用荧光酵素分解D-lucifin产生生物荧光的原理,借以观察与分析小鼠体内癌细胞生长情形而不用牺牲小鼠,因此可以连续收集大量资料,对于抗癌药物筛选及癌细胞在小鼠内对药物反应之作用,可以获得更多的信息。我们拟应用此技术,看是否能应用此技术在我们的原位肺癌小鼠身上。细胞激素在人体内扮演相当重要的角色,免疫细胞与细胞的沟通大部分由细胞激素来传达；细胞激素是一种小分子的蛋白,它可以改变本身或其它细胞的行为；因此,细胞激素量的高低即可代表当时细胞的状态,或者经由调节细胞激素的高低,便可以影响细胞的行为,进而调节动物体内免疫细胞而影响到整个有机体的免疫状态。我们希望以细胞免疫为研究模式,以了解中草药萃取物与细胞免疫反应间的相关性,藉以厘清细胞激素与中草药对提升免疫及抗肿瘤间有何相关性,期能找出一指标性的结果,以利在细胞实验阶段中,即可筛选出具有功效的中草药成分。方法：1.银草合剂对荷肺癌细胞小鼠恶病质影响的实验研究以原位(orthotopic)方式,于小鼠胸腔内植入肺癌H460细胞,诱发小鼠恶病质,并于植入细胞后隔天,喂食中草药以观察小鼠恶病质改善之情形。分析指标以小鼠之体重、摄食量及小鼠血清中之白蛋白、血糖、三酸甘油酯、小鼠存活率等作为评估依据。试验分为Normal、Model、GS(金银花,蒲公英,夏枯草)、GSRS(金银花,蒲公英,夏枯草,丹参)、GSRA(金银花,蒲公英,夏枯草,党参)、SG(黄芪,党参)等共计6组,药物皆为等比例混合萃取,每只小鼠每天喂食中药量为0.2g/kg。2.A549-Luc荧光酵素肿瘤细胞异体接种动物模型：荧光强度与癌块重量相关性之探讨以原位方式于小鼠胸腔内植入肺癌A549细胞,诱发小鼠恶病质,并于植入细胞后测定小鼠胸腔内之荧光强度,以侦测小鼠胸腔内癌细胞之生长情形。小鼠测定完荧光后即安乐死并解剖取出癌块秤重,荧光强度再与癌块重量作一相对曲线,以期能找出两者相对应之关系。3.黄芪及党参萃取物诱导免疫细胞分泌细胞激素暨细胞生长抑制之体外检测分析本实验以细胞免疫为研究模式,以了解中草药黄芪、党参萃取物(DSUF3K, DSUFPS, SGHF3, HGUFPS,HGF3和HGW)与细胞免疫反应间的相关性,藉以厘清细胞激素与中草药对提升免疫及抗肿瘤间有何相关性；并进一步探讨萃取液对PBMC细胞刺激后之condition medium (CM)对U937cell line之生长抑制情形。结果：1.银草合剂对荷肺癌细胞小鼠恶病质影响的实验研究胸腔植入肺癌H460细胞的确诱发小鼠恶病质,小鼠体重及其生化指标都明显下降。所测试之药物中,银草合剂具有提升小鼠血清中白蛋白浓度(GS：173.86±15.15ng/ml,Model组155.77±17.02ng/ml,p<0.05)；其它的生化指标中,实验组与对照组并无明显的统计意义。2.A549-Luc荧光酵素肿瘤细胞异体接种动物模型：荧光强度与癌块重量相关性之探讨实验结果显示reporter gene已成功的被植入A549肺癌细胞内。将建立好之A549-Luc细胞以原位(orthotopic)方式胸腔植入后,于每星期测定荧光表现及小鼠体重变化,随即将小鼠牺牲,并取出胸腔内之癌块秤重。实验结果显示荧光强度与癌块重量成正比关系,且在癌块重量大于30mg时,与荧光强度成线性关系。(荧光强度为3.06±1.081、4.22±1.70、4.87±1.61、5.53±4.29x105photons/sec/cell,癌块重量分别为：0.03±0、0.03±0、0.17±0.02、0.28±0.05g),因此,以后类似实验皆可以此为依据,利用荧光强度来推算肿瘤的大小,而减少小鼠的牺牲。3.黄芪及党参萃取物诱导免疫细胞分泌细胞因子暨细胞生长抑制之体外检测实验结果显示,本次受试物DSUF3K, DSUFPS, SGHF3, HGUFPS, HGF3和HGW皆会刺激PBMC产生高浓度的细胞因子,而且有随着浓度升高而成反比的现象。由中草药萃取液对PBMC细胞刺激后之condition medium (CM)对U937cell line之生长抑制实验可知DSUF3K, DSUFPS, SGHF3, HGUFPS, HGF3和HGW在较低浓度所刺激产生之CM对U937Cell line抑制较明显,且萃取液浓度越高,抑制效果越不明显。结论：1.小鼠原位癌植入肺癌H460细胞,的确引发小鼠恶病质,小鼠的摄食量、体重、TG、血糖、白蛋白皆下降,可见此小鼠的恶病质模型的可行性；所测试的指标中,银草合剂具有提升白蛋白的功能(p<0.05),其机制,则可能需进一步探讨,而其余指标则无显著统计义意(p>0.05)。2.活体荧光成像可连续观察肺癌细胞A549在SCID小鼠体内的生长情况,我们发现在接种的第11天就可以观察到肿瘤发光,实验结果显示荧光强度与癌块重量成正比关系,且在癌块重量大于30mg时,与荧光强度成线性关系。3.受试物DSUF3K, DSUFPS, SGHF3, HGUFPS, HGF3和HGW皆会刺激PBMC产生高浓度的细胞因子,而且有随着浓度而成反比的现象,对此我们发现若是对照于PBMC细胞数而言,高浓度的中草药萃取液往往亦会抑制PBMC的生长。由中草药萃取液对PBMC细胞刺激后之CM对U937cell line之生长抑制实验可知DSUF3K, DSUFPS, SGHF3, HGUFPS, HGF3和HGW在较低浓度所刺激产生之CM对U937Cell line抑制较明显,且浓度越高,抑制效果越不明显。此结果与所测得之细胞因子的浓度似乎成正比；但实际由哪些细胞因子引起此一抑制效果,则仍有待进一步探讨。

全文目录

摘要  3-6
ABSTRACT  6-11
目录  11-13
引言  13-15
第一部份文献研究  15-40
  第一章现代医学对肺癌的研究  15-20
    一、肺癌分类  15-16
    二、肺癌的症状  16
    三、肺癌的病因(危险因子)  16-17
    四、肺癌发病机制  17
    五、肺癌的诊断  17
    六、肺癌的预防  17-18
    七、肺癌分期  18
    八、肺癌的治疗  18-20
  第二章中医对肺癌的研究  20-25
    一、前言  20-21
    二、病机  21-22
    三、肺癌治则  22
    四、中药治疗肺癌的实验研究进展  22-24
    五、小结  24-25
  第三章恶病质的研究  25-32
    一、癌性恶病质的特点与机制  25
    二、肿瘤能量代谢异常  25-27
    三、中医治疗思路  27-30
    四、讨论  30-32
  第四章金银花、蒲公英、夏枯草的研究  32-40
    金银花  32-34
    蒲公英  34-37
    夏枯草  37-40
第一部份实验研究  40-73
  第一章银草合剂对荷肺癌细胞小鼠恶病质影响的实验研究  40-52
    1.1 主要实验材料与设备  40
    1.2 实验方法  40-43
    1.3 结果  43-48
    1.4 讨论  48-52
  第二章 A549-Luc荧光酵素肿瘤细胞异体接种动物模型：荧光强度与癌块重量相关性之探讨  52-60
    2.1 主要实验材料与设备  52-53
    2.2 实验方法  53-54
    2.3 结果  54-58
    2.4 讨论  58-60
  第三章黄芪与党参对PBMC细胞的作用研究  60-73
    3.1 实验材料与方法  60-62
    3.2 统计方法与结果分析  62
    3.3 结果  62-70
    3.4 讨论  70-73
全文结语  73-75
参考文献  75-83
附录  83-84
致谢  84

银草合剂对荷肺癌细胞小鼠恶病质影响的实验研究

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