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人端粒酶RNA模板定点突变对肿瘤细胞Bcap-37的作用研究

作　者: 韦敬航
导　师: 刘小川
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 人乳腺癌细胞株Bcap-37 MT-hTER 端粒酶活性端粒长度石蜡切片
分类号: R730.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

端粒是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构，由高度保守的非编码DNA简单重复序列与端粒相关结合蛋白构成的DNA-蛋白质复合体，其主要功能是维持染色体的完整性。端粒会在细胞持续分裂的过程中逐渐缩短，若不能在达到极限长度之前得到有效的延伸，就会引发细胞的衰老及死亡。端粒的延伸需要依靠端粒酶的作用。端粒酶以端粒3’端的G悬突为引物，自身RNA亚基为模板，在端粒酶逆转录酶亚基的催化下逆转录合成端粒DNA序列并添加至端粒末端，使端粒得到延伸。端粒酶活性在正常体细胞中的表达量极少，但在肿瘤细胞和细胞株中却高度表达，这表明端粒酶与肿瘤之间有着密切的联系，并有可能作为人类恶性肿瘤早期诊断的标志物。目前已有较多以端粒、端粒酶为靶标的肿瘤治疗方法，但还不够完善，需进一步研究改进。因为端粒酶RNA模板序列决定了端粒酶所合成端粒DNA的序列特异性，所以模板序列的定点突变可能会对端粒酶的活性造成一定影响，并因此影响端粒的长度和肿瘤细胞的生长活性。本论文旨在从端粒酶活性、端粒长度及细胞凋亡现象这三个不同方面的改变情况揭示hTER模板序列定点突变对人乳腺癌细胞株Bcap-37的作用影响。本论文以人乳腺癌细胞株Bcap-37接种裸鼠增殖形成的肿瘤组织块为研究对象，分为hTER模板序列定点突变（MT-hTER）组和无突变对照组。首先从MT-hTER组样本和对照组样本中提取端粒酶，测定端粒酶蛋白含量后，进行端粒酶酶促反应，即让端粒酶在前导引物的基础上逆转录合成端粒DNA序列并添加至前导引物末端。设正常组和端粒酶灭活处理组，端粒酶灭活处理组的端粒酶在酶促反应前经过灭活处理。终止酶促反应后回收酶促反应产物，利用NanoDrop2000Spectrophotometer测定ssDNA的含量。正常组和端粒酶灭活处理组的ssDNA含量差值可直接反映出端粒酶的活性。通过对比MT-hTER组样本和对照组样本的端粒酶活性即可得到hTER模板序列定点突变对人乳腺癌细胞株Bcap-37端粒酶活性的作用。结果显示，MT-hTER组样本的端粒酶活性低于对照组的端粒酶活性。这提示着hTER模板序列定点突变可能在一定程度上改变了人乳腺癌细胞株Bcap-37的端粒酶活性。从MT-hTER组样本和无突变对照组样本中提取人类基因组DNA，通过T4DNA连接酶使之与特殊接头进行末端连接。根据NCBI数据库中人类基因组DNA序列中的亚端粒序列设计出可特异扩增特定端粒的上游引物。利用PCR技术扩增人乳腺癌细胞Bcap-37特定的染色体端粒，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并通过GeneTools软件定量分析PCR产物总量和1/2总量处的分子量，通过计算即可得到端粒平均长度。结果显示，MT-hTER组样本的端粒平均长度小于对照组的端粒平均长度。这提示着hTER模板序列突变可能在一定程度上改变了人乳腺癌细胞株Bcap-37端粒的平均长度。通过制作人乳腺癌细胞株Bcap-37肿瘤组织块的石蜡切片，经过Feulgen染色处理并封片后，可在光学显微镜下观察到紫红色细胞核的形态。结果显示，MT-hTER组的细胞核形态较不稳定，均一性较差，有较多细胞核致密浓染现象，而对照组的细胞核形态较稳定，均一性较好，较少出现细胞核致密浓染现象。这提示着hTER模板序列突变可能在一定程度上诱导了人乳腺癌细胞株Bcap-37在生长增殖过程中发生细胞凋亡。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
缩略词表  12-15
第一章绪论  15-30
  1.1 端粒和端粒酶概论  15
  1.2 端粒  15-20
    1.2.1 端粒的发现  15-16
    1.2.2 端粒的结构与功能  16-18
    1.2.3 端粒结合蛋白  18-20
  1.3 端粒酶  20-24
    1.3.1 端粒酶的发现  20
    1.3.2 端粒酶的结构  20-22
    1.3.3 端粒酶的功能  22
    1.3.4 端粒酶活性的调控  22-23
    1.3.5 端粒酶亚基突变对端粒酶活性的影响  23-24
  1.4 端粒、端粒酶与肿瘤治疗  24-28
    1.4.1 以端粒酶为靶标的肿瘤治疗  25-27
    1.4.2 以端粒为靶标的肿瘤治疗  27-28
  1.5 本文研究目的及意义  28-30
第二章人乳腺癌细胞 Bcap-37 端粒酶活性的测定  30-37
  2.1 实验材料与试剂  30-31
    2.1.1 实验材料  30-31
    2.1.2 实验试剂  31
  2.2 实验方法  31-34
    2.2.1 人乳腺癌细胞株 Bcap-37 端粒酶的提取  31-32
    2.2.2 端粒酶提取液蛋白含量的测定  32
    2.2.3 端粒酶酶促反应  32-33
    2.2.4 回收酶促反应产物  33-34
    2.2.5 测定酶促反应产物的含量  34
  2.3 结果与分析  34-35
    2.3.1 端粒酶提取液中总蛋白的含量  34-35
    2.3.2 人乳腺癌细胞株 Bcap-37 对照组样本和 MT-hTER 组样本的端粒酶活性对比结果  35
  2.4 小结与讨论  35-37
第三章人乳腺癌细胞株 Bcap-37 端粒长度的测定  37-45
  3.1 实验材料与试剂  37-38
    3.1.1 实验材料  37-38
    3.1.2 实验试剂  38
  3.2 实验方法  38-41
    3.2.1 人乳腺癌细胞株 Bcap-37 基因组 DNA 的提取  38
    3.2.2 基因组 DNA 含量的测定  38-39
    3.2.3 特殊接头的制备  39-40
    3.2.4 连接反应  40
    3.2.5 PCR 反应  40-41
    3.2.6 电泳分析 PCR 产物  41
    3.2.7 GeneTools 软件定量分析  41
  3.3 结果与分析  41-43
    3.3.1 基因组 DNA 含量的测定结果及电泳分析结果  41-42
    3.3.2 端粒 PCR 产物电泳结果分析  42-43
  3.4 小结与分析  43-45
第四章人乳腺癌细胞株 Bcap-37 石蜡切片的制作  45-53
  4.1 实验材料与试剂  45-46
    4.1.1 实验材料  45
    4.1.2 实验试剂  45-46
  4.2 实验方法  46-50
    4.2.1 取材与固定  46
    4.2.2 染色标记  46
    4.2.3 脱水与透明  46-47
    4.2.4 浸蜡与包埋  47-48
    4.2.5 修块与切片  48
    4.2.6 粘片  48-49
    4.2.7 脱蜡与水化  49
    4.2.8 染色剂的配制  49-50
    4.2.9 染色及封片  50
  4.3 结果与分析  50-52
  4.4 小结与讨论  52-53
结论  53-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
攻读硕士研究生期间的研究成果  61

人端粒酶RNA模板定点突变对肿瘤细胞Bcap-37的作用研究

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