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神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

作　者: 张宏男
导　师: 姜国华
学　校: 黑龙江中医药大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 阿尔茨海默病神经干细胞移植 GFP转基因小鼠
分类号: R749.16
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

目的：随着人们生活水平的提高,和社会环境的不断改变,阿尔茨海默病(Alzheimer’S disease, AD)的发病率却呈现了不断且快速上升的趋势,根据大量的医学研究资料显示,对于阿尔茨海默病至今还没有特效药物以及治疗方法。本实验是用纯化了的绿色荧光蛋白(green fluorecent protein,GFP)转基因小鼠的胚胎神经干细胞(neural stem cells, NSCs),进行分离、培养,然后移植到APP/PS1双转基因小鼠脑内的海马中。探讨神经干细胞在修复患鼠脑组织过程中的作用,从而为临床应用神经干细胞来治疗阿尔茨海默病提供理论依据。方法：(1)E14的GFP转基因小鼠内的胚胎,取其端脑,制成神经干细胞悬液进行培养,并进行免疫荧光细胞化学技术来检测所培养干细胞巢蛋白(Nestin)的表达。同时用胎牛血清来诱导神经干细胞进行分化,用MAP-2(神经元特异烯醇化酶),GFAP(胶质纤维酸性蛋白)免疫细胞化学染色,对其所分化成的神经元和星形胶质细胞进行鉴定。(2)E14的C57小鼠内的胚胎,用上述方法制成神经干细胞悬液进行培养,传至4-6代时,以每孔8×104—1×105个细胞/500μl的密度接种于24孔板内,按照复染指数(Multiplicities of infection,MOI)为0,1,5,10,15,20加入携带有GFP基因的慢病毒载体(lent iviral vector-GFP,LV/GFP)稀释液,每六孔为一滴度,共六组。2-3天后置于倒置荧光显微镜下观察其GFP的阳性表达。以流式细胞仪检测各组各组神经干细胞的GFP阳性转染率。(3)根据脑立体定位技术将含有GFP基因的神经干细胞移植到AD小鼠脑内海马中,一周后做水迷宫与旷场试验,以检测小鼠的学习与记忆能力是否有所改善。移植四周后取小鼠脑部采用荧光技术来检测移植后,神经干细胞的存活及迁移能力。结果：体外实验充分证明,从E14的胎鼠端脑内可以成功的分离培养出神经干细胞,并且此细胞中绝大多数可以表达神经干细胞的标志物——巢蛋白(Nestin);在胎牛血清分化培养基的诱导下,神经干细胞具有多方向分化的潜能,其中少数干细胞可以分化成被MAP-2表达的神经元,多数可以分化成被GFAP所表达的星形胶质细胞。神经干细胞转染GFP基因后,除MOI=0组以外,2-3天后各孔的GFP均有表达。且随着MOI值的增加而阳性表达率亦增加。MOI=0-10时,P<0.05。通过行为学检测,在学习与记忆能力上,细胞移植组的小鼠比模型组有差异(P<0.05),与对照组比较差异无显著性(P>0.05).免疫组织化学技术检测：移植后的神经干细胞不仅能够可以很好与AD小鼠的脑组织进行整合,而且可以在AD小鼠脑组织内进行迁移。结论：神经干细胞在无血清完全培养基培养下可以很好的存活,并且大量增殖。移植脑组织海马区后可以完成迁移与整合。神经干细胞对阿尔茨海默病的治疗有一定疗效。同时慢病毒可以作为将外源基因转入到神经干细胞的理想载体。

全文目录

英文缩写  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
引言  10-12
文献综述  12-30
  综述1  12-22
    1 阿尔茨海默病的流行病学  12
    2 现代医学对AD的认识和研究  12-14
      2.1 AD的历史  12-13
      2.2 AD的诊断  13
      2.3 AD的病理学  13-14
    3 中医学对AD的认识  14-15
      3.1 古籍对AD的描述  14-15
      3.2 中医学对AD病因病机的认识  15
    4 AD的治疗  15-17
      4.1 西医治疗  15-16
      4.2 中医治疗  16-17
    5 阿尔茨海默病的模型  17-22
      5.1 单转基因小鼠  19-20
      5.2 双转基因小鼠  20
      5.3 三转基因小鼠  20-22
  综述2  22-30
    1 神经干细胞的概念  22
    2 神经干细胞的分布  22-23
    3 神经干细胞的来源  23
    4 神经干细胞的增殖、分化与鉴定  23-26
    5 神经干细胞的研究方向  26
    6 人类神经干细胞的研究  26-28
    7 神经干细胞用于AD治疗的可行性  28
    8 神经干细胞治疗AD面临的问题  28
    9 神经干细胞应用前景  28-30
材料与方法  30-39
  1 实验材料  30-32
    1.1 实验动物及分组  30
    1.2 主要试剂/试剂盒  30
    1.3 仪器设备  30-31
    1.4 主要溶液配制  31-32
  2 实验方法  32-33
    2.1 神经干细胞的单细胞悬液制备  32-33
    2.2 半量换液方法  33
    2.3 传代培养  33
  3 神经干细胞的鉴定--巢蛋白(Nestin)  33-34
  4 神经干细胞的诱导分化、鉴定  34
    4.1 神经干细胞的诱导分化  34
    4.2 神经干细胞分化的鉴定  34
  5 慢病毒转染神经干细胞  34-35
  6 行为学  35-36
  7 移植  36-37
  8 脑组织的取材和冰冻切片制备  37
  9 脑组织切片HE染色  37-38
  10 统计学处理  38-39
结果  39-42
  1 神经干细胞的培养与鉴定  39-40
    1.1 神经干细胞的原代及传代培养  39
    1.2 神经干细胞的鉴定  39
    1.3 神经干细胞的分化以及分化鉴定  39-40
    1.4 神经干细胞的慢病毒转染检测  40
  2 神经干细胞对APP/PS1双转基因小鼠学习记忆的影响  40
    2.1 旷场实验  40
    2.2 Morris水迷宫实验  40
  3 神经干细胞对APP/PS1双转基因小鼠脑组织的影响  40-42
讨论  42-46
  1 阿尔茨海默病动物模型  42
  2 移植后神经干细胞存活  42-43
  3 移植神经干细胞后的迁移  43-44
  4 慢病毒介导GFP基因转染神经干细胞  44
  5 移植神经干细胞后APP/PS1小鼠的行为学改变  44-45
  6 移植神经干细胞治疗阿尔茨海默病的可能机制  45
  7 应用展望  45-46
结论  46-47
致谢  47-48
参考文献  48-57
附录  57-62
攻读博、硕士学位期间发表的论文  62-64
个人简历  64

神经干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

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