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心可舒防治短暂性脑缺血药理机制的实验研究

作　者: 张滔滔
导　师: 蔡大勇
学　校: 北京中医药大学
专　业: 中西医结合基础
关键词: 心可舒短暂性脑缺血超氧化物歧化酶一氧化氮合酶
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

世界卫生组织疾病死亡报告中,脑血管意外是人类第3位死因,是中国人第2位死因亡(次于癌症,高于心梗)。其中,高胆固醇血症致脑动脉粥样硬化是脑缺血的主要病理基础。短暂性脑缺血(transient ischemic attack, TIA)是病情加重≤60分钟且病情维持≤24小时的脑机能障碍症状群。TIA的始动发病机制为脑动脉的可溶性栓塞与可逆性痉挛,属于脑血供障碍,即脑血流自身调控(总量)与神经血管偶联(分布)相关的病理生理学机制。由于可预警中风与痴呆发病,逆转TIA进展是我国重要科研课题。心可舒是防治心阳虚证的经典方剂。依据心主血脉与心主神明,本学位论文课题配合心可舒防治心肌梗死前期工作,主要研究“心可舒防治短暂性脑缺血”的药理机制。日本大耳白家兔,序贯实施高脂饲养与动脉痉挛干预,建立TIA模型。高脂饲养12周模拟脑血管内皮舒张不足,4次精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)静脉注射模拟脑动脉痉挛。同步口服心可舒,防治TIA模型家兔；结果提示心可舒剂量依赖性防治TIA进展,关键药理机制在于“提高动脉内皮一氧化氮生物利用度,恢复神经血管偶联调控”。1精氨酸加压素诱导脑动脉痉挛的量效关系①目的：诱导家兔出现心电图性心肌缺血精氨酸加压素的量效关系。②方法：100只雄性日本大耳白家兔,体重均衡随机分10个剂量组,每组10只,AVP剂量范围为295.28～2952.76mU/kg(k=0.5)；静脉注射时出现心电图ST段抬高判断为阻力血管发生短暂痉挛,计算AVP累积剂量(PAD)和半数有效剂量(EDso)。③结果：AVP诱导生理状态家兔PAD为1449.0±38.7mU/kg,ED50为1414.0mU/kg。PAD低于ED50的家兔为对AVP动脉痉挛敏感动物。④结论：静脉注射AVP剂量依赖性诱导阻力动脉短暂痉挛,具有S量效曲线。2精氨酸加压素建立高脂血症家兔短暂性脑缺血模型①目的：脉粥样硬化家兔监测心电图性缺血,静脉注射AVP,建立TIA模型。②方法：36只AVP敏感性雄性日本大耳白兔随机分为3组。对照组干预溶媒同步处理；模型组高脂饲养12周,d00、d28、d56、d84静脉注射AVP出现心电图性缺血,建立TIA模型；同步口服阿伐他汀(5.0mg/Kg)验证模型的内皮依赖性。病变观察确认脑动脉粥样硬化,计算AVP的PAD和ED50,及其与高脂饲养性高脂血症的时效关系。③结果：3组动物随年龄增加,AVP量效曲线均右移,提示内源性高胆固醇参与决定脑动脉的反应性,包括内皮性舒张降低和平滑肌细胞效能减弱。高脂饲养使AVP量效曲线均右移,口服阿伐他汀降低右移程度；在中度与重度高胆固醇血症期,PAD组间具有显著性差异(P<0.05)。AUC曲线下面积变化比与病变程度变化比之间出现负相关(P<0.05),病变包括高胆固醇血症、主动脉粥样斑块面积、颈动脉内膜增厚、中央前回大脑皮质尼氏体染色体积比(神经元变性程度)、海马CA1区单位体积颗粒细胞密度比(神经元丢失程度)、中央前回大脑皮质血管周围水肿体积比(内皮损伤程度)等。日本雄性大耳白家兔持续饲养高脂饲料12周,4次静脉注射AVP诱导阻力动脉痉挛,建立了模拟人类TIA的家兔模型。从胆固醇代谢、伴随病灶、内皮损伤程度、阻力血管反应性、大脑运动皮质变性、海马神经元丢失等病理或病理生理效能变化上,具备人类TIA的基本特征；其中,内源性氧化应激累积效应相关的老化机制主导发病,伴有“甲状腺机能低下与胆固醇合成激活”的高胆固醇血症促进发病,AVP对脑阻力动脉的诱导痉挛启动与诱发发病的症状环节。④结论：对家兔序贯实施“持续高脂饲养与脑动脉痉挛”所建立TIA模型,基本具有TIA临床患者的病理生理学特征,可用于候选药筛选与临床风险评估。3心可舒防治短暂性脑缺血的病机性药效脑动脉发生动脉粥样硬化,通过促发栓塞与痉挛,成为TIA的主导病因。在临床试验与动物研究中,以颈动脉动脉粥样硬化状态代表脑动脉病变。①目的：通过阻止脑动脉基础病变,心可舒防治TIA的作用效应。②方法：AVP诱导阻力动脉痉挛的PAD≤ED50为标准,选择动脉痉挛敏感性日本大耳雄性白家兔72只。体重、敏感性与血浆胆固醇3因素均衡随机分6组,每组12只。对照组标准饲料饲养,模型组高脂饲料饲养,阳性药组高脂饲料追加阿伐他汀(5.0mg/Kg)饲养,心可舒低、中、高剂量组高脂饲料追加心可舒片(184.8、369.6、739.2mg/kg)饲养,连续84天。其中,d00、d28、d56、d84静脉注射AVP出现心电图性缺血。d00与d84取血检测血浆相关代谢物含量；d85皮下注射水合氯醛麻醉,灌注固定取材,常规石蜡包埋颈动脉起始段,6μm切片,HE染色形态计量内膜体积比；6μm切片,Masson染色形态计量胶原纤维体积比；常规石蜡包埋中央前回大脑皮质,6μm切片,HE染色形态计量毛细血管周围水肿体积比。t检验比较组间差异的显著性(P<0.05)。③结果：除“血脂变化与AS病灶”外,颈动脉内膜体积比代表发作前脑动脉狭窄,颈动脉中膜胶原体积比代表发作前脑动脉舒张阻力,皮质毛细血管水肿代表发作后内皮损害。(A)动脉狭窄：①与对照组比较,造模各组依次增加110.80%、11.17%、65.07%、35.50%、4.74%(P<0.01)。②与模型组比较,各治疗组依次降低47.26%、21.69%、35.72%、50.31%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组升高,高剂量组降低(P<0.01)。④心可舒疗效有剂量依赖趋势(P<0.01)。(B)舒张阻力：①与对照组比较,造模各组依次增加77.79、5.70、32.58、21.44、8.36倍(P<0.01)。②与模型组比较,各治疗组依次降低91.49%、57.38%、71.52%、88.13%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组升高,高剂量组降低(P<0.01)。④心可舒疗效有剂量依赖趋势(P<0.01)。(C)血管水肿：①与对照组比较,造模各组依次增加192.56、3.27、79.02、7.38、1.423倍(P<0.01)。②与模型组比较,各治疗组依次降低97.79%、58.66%、95.67%、98.75%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组升高,高剂量组降低(P<0.05)。④心可舒疗效有剂量依赖趋势(P<0.01)。④结论：尽管缓解高胆固醇血症无显著作用,心可舒减轻动脉狭窄、降低舒张阻力与逆转内皮损害,参与了TIA的防治效应。依据家族性高胆固醇血症TIA的病理生理学,提高脑循环舒张物生物利用度是心可舒防治TIA的可能机制。4心可舒防治短暂性脑缺血的病机性药理脑循环舒张物生物利用度参与心可舒病机药理,NO起效最快、作用最强的舒张物,ecSOD是全程保护NO的关键酶,ecSOD提高NOSs源性NO生物利用度,成为研究焦点。①目的：依据NOSs及ecSOD原位分布,判断心可舒防治TIA与提高NO效能有关。②方法：选择AVP敏感性雄性白家兔72只。3因素均衡随机分6组,每组12只。对照组标准饲料,模型组高脂饲料,阳性药组追加阿伐他汀(5.0mg/Kg),心可舒低、中、高剂量组追加心可舒(184.8、369.6、739.2mg/kg)。4次静脉注射AVP出现心电图性缺血。d85水合氯醛麻醉,血检测血浆相关代谢物含量；灌注固定取材,常规石蜡包埋右侧颈动脉起始段,6μm切片,免疫组织化学染色,光学显微镜观察ecSOD、 iNOS、 eNOS阳性颗粒的细胞定位与亚细胞器定位,形态计量ecSOD、 iNOS、 eNOS局部表达强度(OD/V)。分离干净左侧颈动脉起始段外周结缔组织,固定剂灌注前,切取剪碎,秤重后按RTPCR保存标本,分别逆转录扩增ecSOD、 iNOS、eNOS,2-△△ct计算mRNA模板相对含量。t检验比较组间差异的显著性(P<0.05)。确定NO来源及转运效率,判断NO生物利用度。③结果：动脉ecSOD保护iNOS与eNOS,逆转“硝基化修饰”损害动脉舒张与溶栓机能。(A) ecSOD原位蛋白：①与对照组比较,造模各组ecSOD单位体积表达总量降低,依次下降98.07%、66.81%、93.58%、87.11%、23.35%(P<0.01)；提示模型抗氧化保护能力减低。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高16.19、2.32、5.68、38.70倍(P<0.01)；提示治疗增强抗氧化能力。③与阳性药组比较,低中剂量组降低80.67%和61.15%(P<0.05),高剂量组增加130.95%(P<0.01)；提示高剂量组疗效优于阳性药。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。ecSOD-mRNA:效能单位上,对照组表达ecSOD-mRNA最多,看做基线(0.00±0.45),模型组降低幅度最大限值(1.00±0.01)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.81±0.02)、低剂量组(0.93±0.01)、中剂量组(0.88±0.00)、高剂量组(0.74±0.03)；提示治疗增强抗氧化作用,与上调ecSOD表达,增加酶合成有关。(B)iNOS原位蛋白：①与对照组比较,造模各组iNOS单位体积表达总量增加,依次上升27.12、6.05、19.45、10.92、5.22倍(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回降,依次降低74.93%、27.24%、57.60%、77.89%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组升高(P<0.05),高剂量组降低(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回降原位酶蛋白含量(P<0.01)。iNOS-mRNA效能单位上,对照组表达iNOS-mRNA最少看做基线(0.00±0.13),模型组增加幅度最大(1.00±0.03)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.85±0.01)、低剂量组(0.91±0.03)、中剂量组(0.83±0.01)、高剂量组(0.76±0.07)；提示治疗增强抗氧化作用,与上调iNOS表达,增加酶合成有关。(C) eNOS原位蛋白：①与对照组比较,造模各组eNOS单位体积表达总量降低,依次下降80.93%、56.95%、74.14%、69.56%、34.76%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高125.76%、35.63%、59.61%、242.13%、(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组降低39.92%和29.30%(P<0.05),高剂量组增加51.54%(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。eNOS-mRNA:效能单位上,对照组表达eNOS-mRNA最多看做基线(0.00±0.07),模型组降低幅度最大(1.00±0.01)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.91±0.00)、低剂量组(0.96±0.01)、中剂量组(0.92±0.01)、高剂量组(0.81±0.02)；提示治疗上调eNOS表达,促进血管舒张。④结论：心可舒上调局部ecSOD表达,eNOS增加与抑制iNOS与表达,提高NO生物利用度,舒张脑阻力动脉,增强神经血管偶联调控,防治TIA的发生发展。5心可舒防治短暂性脑缺血的保护性药效由于可溶性栓塞与可逆性痉挛,TIA患者发作时出现短暂神经机能障碍,反复发作后呈现慢性神经组织萎缩,即当时的与后续的脑损害。神经血管偶联机制异常是形成恶性循环的启动环节之一,运动皮层大椎体神经元与海马颗粒神经元是此类脑损害的主要靶细胞。①目的：通过阻止脑损害,心可舒防治TIA模型家兔的作用效应。②方法：以AVP的PAD≤ED50选择敏感性日本大耳雄性白家兔72只。3因素均衡随机分6组,每组12只。对照组饲以标准饲料,模型组饲以高脂饲料,阳性药组饲以高脂饲料追加阿伐他汀(5.0mg/Kg),心可舒低、中、高剂量组饲以高脂饲料追加心可舒(184.8、369.6、739.2mg/kg),连续84天。其中,d00、d28、d56、d84静脉注射AVP出现心电图性缺血。检测血浆相关代谢物含量,灌注固定石蜡包埋中央前回大脑皮质与海马CA1区,6μm切片,HE染色与尼氏体染色。40倍物镜下分别形态计量中央前回大脑皮质大椎体神经元层尼氏体阳性染色的体积比与海马CA1区颗粒神经元层的细胞密度；每只动物5个随机视野的平均值为统计数据。t检验比较组间差异的显著性。③结果：除血脂变化外,皮质尼氏体阳性染色面积比提示神经元变性程度,海马存活细胞密度提示神经元丢失程度。(A)神经元变性：中央前回皮质大椎体细胞层尼氏体染色阳性体积比。①与对照组比较,造模各组体积比降低,依次下降96.85%、85.79%、93.50%、89.35%、77.90%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高3.51、1.06、2.38、6.02倍(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组降低54.28%和25.05%(P<0.05),高剂量组增加55.57%(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。(B)神经元丢失：海马CA1区颗粒细胞层单位面积的颗粒细胞核数量,对照组密度最高,模型组最低。形态计量分析结果(表8-1)显示：①与对照组比较,造模各组体积比降低,依次下降66.56%、34.77%、57.78%、52.98%、10.60%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高95.05%、26.24%、40.59%、167.33%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组降低35.28%和27.92%(P<0.05),高剂量组增加37.06%(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回升存活细胞密度(P<0.01)。④结论：尽管对高胆固醇血症的缓解作用不明显,心可舒可减轻神经元变性、降低神经元丢失、阻止脑TIA损害,参与了的防治效应。依据神经血管偶联生理调控与TIA病理机制,提高脑循环NO生物利用度可能参与心可舒药效机制。6心可舒防治短暂性脑缺血的保护性药理心可舒保护性药效与脑循环NO生物利用度密切相关,ecSOD是全程保护“NO生成、转运、效应”的关键酶,ecSOD提高NO生物利用度,可能恢复神经血管偶联的前馈机制。①目的：判断"ecSOD超前保护NOSs产物”,恢复神经血管偶联前馈机制,是心可舒防治TIA脑损害的主导药理机制。②方法：72只AVP敏感性雄性家兔,3因素均衡随机分6组,每组12只。以阿伐他汀(5.0mg/Kg)为对照,与TIA造模同步,低(184.8mg/kg)、中(369.6mg/kg)、高(739.2mg/kg)剂量心可舒防治给药12周。确认模型指标外,免疫组化与形态计量ecSOD与NOSs的原位含量,逆转录扩增mRNA的模版数量,蛋白斑点分析酶蛋白总量；t检验比较组间差异(P<0.05),4酶回归分析,判断ecSOD的保护超前。③结果：大脑ecSOD保护NOSs,逆转“硝基化修饰”,保护脑损害。(A) ecSOD原位蛋白：①与对照组比较,造模各组ecSOD单位体积表达总量降低,依次下降92.27%、74.09%、84.99%、79.59%、47.17%(P<0.01)；提示模型抗氧化保护能力减低。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高234.95%、94.00%、163.94%、583.07%(P<0.01)；提示治疗增强抗氧化能力。③与阳性药组比较,低中剂量组降低42.08%和21.20%(P<0.05),高剂量组增加252.09%(P<0.01)；提示高剂量组疗效优于阳性药。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。ecSOD-mRNA:效能单位上,对照组表达ecSOD-mRNA最多看做基线(0.00±0.11),模型组降低幅度最大限值(1.00±0.00)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.56±0.10)、低剂量组(0.99±0.01)、中剂量组(0.74±0.07)、高剂量组(0.30±0.08)；提示治疗增强抗氧化作用,与上调ecSOD表达,增加酶合成有关。(B) iNOS原位蛋白：①与对照组比较,造模各组iNOS单位体积蛋白质减少,依次下降80.68%、67.17%、60.74%、44.67%、9.85%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高69.98%、103.25%、186.44%、366.73%(P<0.01)。③与阳性药组比较,心可舒分别升高19.57%、68.51%、174.57%(P<0.01)。④心可舒回降原位蛋白含量(P<0.01)。iNOS-mRNA表达：效能单位上,对照组表达iNOS-mRNA最少看做基线(0.0000±0.0767),模型组增加幅度最大(1.0000±0.1010)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.4513±0.0413)、低剂量组(0.8236±0.0473)、中剂量组(0.6108±0.0789)、高剂量组(0.2588±0.1413)；提示治疗增强抗氧化作用,与上调iNOS表达,增加酶合成有关。(C) eNOS原位蛋白：①与对照组比较,造模各组eNOS单位体积表达总量降低,依次下降87.33%、57.44%、83.70%、76.32%、31.32%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高236.01%、28.72%、86.93%、442.20%(P<0.01)。③与阳性药组比较,低中剂量组降低61.69%和44.37%(P<0.05),高剂量组增加61.36%(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。eNOS-mRNA:效能单位上,对照组表达eNOS-mRNA最多看做基线(0.00±0.03),模型组降低幅度最大(1.00±0.00)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.24±0.01)、低剂量组(0.89±0.08)、中剂量组(0.52±0.11)、高剂量组(0.14±0.02)；提示治疗上调eNOS表达,促进血管舒张。(D) nNOS原位蛋白：①与对照组比较,造模各组nNOS单位体积表达总量降低,依次下降73.01%、65.37%、54.49%、41.59%、21.86%(P<0.01)。②与模型组比较,治疗各组表达总量回升,依次升高28.29%、68.58%、116.40%、189.48%(P<0.01)。③与阳性药组比较心可舒分别增加31.40%、68.68%、125.65%(P<0.01)。④心可舒剂量依赖回升原位酶蛋白含量(P<0.01)。nNOS-mRNA:效能单位上,对照组表达nNOS-mRNA最多看做基线(0.00±0.20),模型组降低幅度最大(1.00±0.00)；各治疗组(P<0.01)降低幅度依次为阳性药组(0.69±0.03)、低剂量组(0.99±0.01)、中剂量组(0.92±0.03)、高剂量组(0.29±0.08)；提示治疗上调nNOS表达,促进血管舒张。④结论：心可舒上调脑组织ecSOD优先于上调NOSs,具有恢复神经血管偶联的前馈特征。继而保护iNOS氧化应激损伤,提高eNOS动脉解痉,增强nNOS前馈调控,是心可舒防治TIA脑损害的主导药理机制。综上所述,本硕士论文课题,建立了家兔TIA模型,验证了心可舒病机性与保护性2类药效,探索了2类药效共有药理机制。心可舒药理作用环节为ecSOD提高NO生物利用度,即超前上调ecSOD,保护NOSs,提高NO利用度；通过iNOS主要控制氧化应激,通过eNOS防止动脉痉挛,通过nNOS增强前馈调控。该实验的突出遗憾是有待探索心可舒有效成分。

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中文摘要  4-10
ABSTRACT  10-20
英文缩略词  20-21
文献综述一短暂性脑缺血的发病机制  21-33
  参考文献  27-33
文献综述二短暂性脑缺血的证候传变  33-39
  参考文献  36-39
文献综述三心可舒防治短暂性脑缺血的药理作用  39-45
  参考文献  41-45
前言  45-46
实验一精氨酸加压素诱导脑动脉痉挛的量效关系  46-48
  材料与方法  46
  结果  46-47
  讨论  47
  结论  47
  参考文献  47-48
实验二精氨酸加压素建立高脂血症家兔短暂性脑缺血模型  48-56
  材料与方法  48-49
  结果  49-52
  讨论  52-53
  结论  53
  参考文献  53-56
实验三心可舒防治短暂性脑缺血的病机性药效  56-62
  材料与方法  56-57
  结果  57-59
  讨论  59-60
  结论  60
  参考文献  60-62
实验四心可舒防治短暂性脑缺血的病机性药理  62-71
  材料与方法  62-66
  结果  66-69
  讨论  69
  结论  69
  参考文献  69-71
实验五心可舒防治短暂性脑缺血的保护性药效  71-74
  材料与方法  71
  结果  71-73
  讨论  73
  结论  73
  参考文献  73-74
实验六心可舒防治短暂性脑缺血的保护性药理  74-79
  材料与方法  74
  结果  74-77
  讨论  77-78
  结论  78
  参考文献  78-79
结语  79-80
致谢  80-81
个人简历  81-82
附图  82-96

心可舒防治短暂性脑缺血药理机制的实验研究

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