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PARP抑制剂联合顺铂对乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖抑制作用和诱导凋亡的实验研究

作 者: 张蕾
导 师: 张丽
学 校: 南京理工大学
专 业: 化学工程
关键词: PARP抑制剂 顺铂 人基底细胞样型乳腺癌 抑制增殖 细胞凋亡
分类号: R737.9
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


目的探讨PARP抑制剂HD-199、HD-199-M单独使用及分别与DDP联合应用对人乳腺癌细胞MDA-MB-231体外增殖的抑制作用,及:二者分别与DDP联合是否有协同作用。为该PARP抑制剂的研发提供实验依据,期望可为临床改善乳腺癌的预后提供新的有效的药物。方法体外培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞,倒置光学显微镜下观察药物作用前后细胞形态学的改变,用四甲基偶氮唑盐(tetrazolium-based colorimetric assay,MTT)比色法分别测定HD-199(5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml)、HD-199-M(5μg/ml、45μg/ml)及DDP(5μg/ml)单独用药对人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h、48h及72h的抑制作用,同时测定HD-199、HD-199-M在5μg/ml、45μg/ml两个浓度下分别与DDP(2.5μg/ml)联合应用对人乳腺癌MDA-MB-231细胞24h、48h及72h的抑制效果,并用q值评价其联合效应;Hoechst 33342/PI双染法测定HD-199(15μg/ml)、HD-199-M(15μg/ml)单独或与DDP(2.5μg/ml)联合应用对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡的影响;Annexin V-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测HD-199(15μg/ml)、HD-199-M(15μg/ml)单独或与DDP(2.5μg/ml)联合作用24h、48h及72h后人乳腺癌细胞MDA-MB-231的凋亡率。结果1.倒置显微镜的观察结果可见,加药组细胞数目明显减少,细胞的形态发生改变,细胞皱缩,有细胞碎片及颗粒物质形成,在显微镜下可看到凋亡或者或者坏死细胞的折光率变弱,细胞边缘不清晰。随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞数目逐步减少,可见较多的坏死和凋亡细胞。2.HD-199在5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml三个浓度下可抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,24h的抑制率依次为4.54±1.20%、8.18±1.11%、10.7±1.05%;48h的抑制率依次为9.31±2.08%、10.9±1.31%、12.6±2.11%;72h的抑制率依次为6.45±2.24%、10.9±1.92%、13.4±2.12%。HD-199-M在5μg/ml、15μg/ml、45μg/ml三个浓度下亦能抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,其24h的抑制率依次为10.0±2.06%、20.3±1.24%、37.1±2.19%;48h的抑制率依次为23.2±2.19%、29.9±3.08%、41.4±2.26%;72h的抑制率依次为21.2±2.16%、34.3±2.27%、55.0±1.55%。由以上数据可知,该PARP抑制剂对乳腺癌细胞的增殖抑制呈剂量和时间的依赖性(P<0.01)。3.DDP在5μg/ml对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞有很好的抑制作用,其24h、48h、72h的OD值依次为0.287+0.012、0.379±0.010、0.434±0.011,与空白对照组24h、48h、72h的OD值0.443±0.005、0.765±0.006、1.208±0.007相比,OD值减小;抑制率依次为35.2+2.37%、50.4+1.63%、64.0±2.13%,比HD-199单药组和HD-199-M单药组的抑制效果好。4.15μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP联合用药组24h、48h、72h的q值依次为1.36、1.32、1.25; 45μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP联合用药组24h、48h、72h的q值依次为1.39、1.36、1.27;其q值均大于1.1.5,表示两药联合使用具有增效作用;15μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP联合用药组24h、48h、72h的q值依次为0.65、1.27、1.14,24h的q值小于0.85,表示两药联合应用具有拮抗作用,48h的q值大于1.15,表示两药联合应用具有增效作用,72h的q值在0.85~1.15范围内,表示两药联合应用具有相加作用;45μg/mlHD-199+2.5μg/mlDDP联合用药组24h、48h、72h的q值依次为0.95、1.26、1.15,24h的q值在0.85~1.15范围内,表示两药联合应用具有加和作用;48h、72h的q值大于1.15,表示两药联合应用具有增效作用。HD-199与DDP联合应用对MDA-MB-231细胞抑制效果的增加要比HD-199-M与DDP联合应用对MDA-MB-231细胞抑制效果的增加要明显。5. Hoechst 33342/PI双染法在荧光显微镜下可见空白对照组细胞核的Hoechst着色形态呈圆形、淡蓝色、核内有较深的蓝色颗粒、染色质分布均匀:用药组细胞部分呈现细胞体积缩小,核仁减少或者消失,胞浆浓缩,染色质浓缩。6. Annexin V-FITC/PI双染法检测结果表明,15μg/mlHD-199单药组24h、48h、72h的凋亡率分别为8.6+0.99%、10.54±0.92%、13.8±1.65%,晚期凋亡细胞在总的凋亡细胞占的比例依次为52.3%、55.2%、52.9%; 15μg/mlHD-199-M单药组24h、48h、72h的凋亡率分别为10.2±1.91%、12.7±1.37%、15.0±1.54%,晚期凋亡细胞在总的凋亡细胞占的比例依次为51.0%、49.6%、50.7%; 15μg/mlHD-199-M+2.5μg/mlDDP组24h、48h、72h的凋亡率分别为16.3±1.12%、17.8+1.29%、19.8+0.89%,晚期凋亡细胞在总的凋亡细胞占的比例依次为53.4%、57.9%、63.1%; 45μg/mlHD-199-M+2.5μg/mlDDP组24h、48h、72h的凋亡率分别为17.3±1.79%、20.1±1.33%、23.2+1.42%,晚期凋亡细胞在总的凋亡细胞占的比例依次为54.3%%、57.7%、57.8%,可知经药物作用后晚期凋亡细胞在总的凋亡细胞中占较大的比例。结论1. HD-199、HD-199-M在一定范围内能抑制MDA-MB-231细胞的增殖,并呈现浓度和时间的依赖性。2.DDP对乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞有很好的抑制作用,比HD-199单药组及HD-199-M单药组的抑制都要强。3.低毒剂量的HD-199、HD-199-M与DDP联合使用能增强对MDA-MB-231细胞的增殖抑制,两者联合使用具有一定的协同作用。4. HD-19、HD-199-M分别与DDP联合用药对MDA-MB-231细胞的增殖抑制效应增强,在总的凋亡细胞中,早期凋亡细胞及晚期凋亡细胞随着作用时间的延长而增加,呈现时间依赖性,这表示两药联合后诱导细胞凋亡的效果增强。

全文目录


摘要  5-8
Abstract  8-11
英文缩略词表  11-14
第一章 绪论  14-27
  1.1 乳腺癌的分子分型  14
    1.1.1 分子分型的提出  14
  1.2 基底细胞样乳腺癌(basal-like breast cancer,BLBC)  14-17
    1.2.1 基底细胞样乳腺癌(BLBC)的形态学特点  15
    1.2.2 基底细胞样乳腺癌(BLBC)的临床特征  15-16
    1.2.3 基底细胞样乳腺癌(BLBC)与三阴性乳腺癌的关系(TNBC)  16
    1.2.4 基底细胞样乳腺癌(BLBC)的治疗现状  16-17
  1.3 DDP  17-19
    1.3.1 DDP的概况  17
    1.3.2 DDP的药理作用  17
    1.3.3 DDP的缺陷及对策  17-18
    1.3.4 DDP与乳腺癌  18-19
  1.4 PARP抑制剂  19-26
    1.4.1 PARP概况  19
    1.4.2 PARP的结构亚型和生物活性  19-21
    1.4.3 PARP与细胞凋亡及坏死  21
    1.4.4 PARP与细胞凋亡诱导因子  21-22
    1.4.5 PARP与肿瘤的发生  22
    1.4.6 PARP抑制剂的构效关系  22-24
    1.4.7 PARP-1抑制剂在恶性肿瘤治疗方而的应用  24-25
    1.4.8 PARP-1抑制剂在治疗乳腺癌方而的应用  25-26
  1.5 HD-199及HD-199-M  26
  1.6 研究思路  26
  1.7 本研究的必要性和创新性  26-27
第二章 实验材料和方法  27-37
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 细胞株  27
    2.1.2 主要试剂及材料  27
    2.1.3 主要仪器设备及耗材  27-28
  2.2 实验方法  28-37
    2.2.1 试剂的配制  28-29
    2.2.2 细胞株的培养  29-30
    2.2.3 MTT比色法检测PARP抑制剂对MDA-MB-231细胞的增殖抑制作用  30-32
    2.2.4 细胞凋亡的检测  32-36
    2.2.5 统计学处理  36-37
第三章 实验结果  37-61
  3.1 倒置显微镜观察PARP抑制剂及DDP对MDA-MB-231细胞形态学的影响  37-40
  3.2 MTT比色法测定PARP抑制剂、DDP对MDA-MB-231细胞增殖的影响  40-50
    3.2.1 PARP抑制剂及DDP单独用药对MDA-MB-231细胞的生长抑制  40-45
    3.2.2 PARP抑制剂与DDP联合应用对MDA-MB-231细胞的生长抑制  45-50
  3.3 细胞凋亡的检测结果  50-61
    3.3.1 Hoechst 33342、PI双染法检测MDA-MB-231细胞的凋亡的检测结果  50-57
    3.3.2 AnnexinV-FITC/PI双染法检测MDA-MB-231细胞凋亡的检测结果  57-61
第四章 讨论与结论  61-65
  4.1 讨论  61-64
  4.2 进一步设想  64
  4.3 发展与展望  64-65
致谢  65-66
参考文献  66-73

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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