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Tautomycetin对乳腺癌细胞增殖的抑制作用及机制

作　者: 牛铭山
导　师: 邱荣国; 包永明
学　校: 大连理工大学
专　业: 生物化工
关键词: Tautomycetin 磷酸酶抑制剂 Akt 抗肿瘤活性
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 23次
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内容摘要


Tautomycetin (TMC)最初是从土壤链霉菌中分离得到的具有抗真菌活性的聚酮化合物。近几年又发现,TMC是蛋白磷酸酶PP1特异性抑制剂,具有免疫抑制活性,并且可以特异性抑制结肠癌细胞生长。但是,TMC抑制肿瘤细胞生长是否与其抑制PP1活性相关未得到证明,抑制肿瘤细胞生长的机制还未详细阐明。我们的前期实验发现TMC并不是特异性抑制结肠癌细胞生长,它对乳腺癌等多种细胞系具有显著生长抑制作用。本研究阐明了TMC的肿瘤细胞生长抑制活性与PP1抑制活性之间是否相关,并重点研究了TMC抑制乳腺癌细胞生长的信号通路,具体研究结果及结论如下：(1)采用MTT和磷酸酶PP1活性测定等方法,测定TMC及其不同衍生物的磷酸酶PP1抑制、肿瘤细胞生长抑制和免疫抑制活性。结果显示：多个衍生物具有较强的PP1抑制活性,却没有显著的肿瘤细胞生长抑制和免疫抑制活性；而部分衍生物具有较强的肿瘤细胞生长抑制活性,PP1抑制活性却不显著；TMC1μmol/L和衍生物TMC-F150μmol/L都能抑制MCF-7细胞内PP160%的活性,而对MCF-7细胞增殖的抑制率分别为90%和24%。表明TMC的肿瘤细胞生长抑制与免疫抑制活性不是通过其蛋白磷酸酶PP1抑制活性实现的。(2)采用MTT、Transwell细胞迁移和侵袭实验和流式细胞术等方法检测TMC对MCF-7细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果显示：TMC抑制MCF-7细胞增殖的ICso值为0.36μmol/L; TMC0.4μmol/L抑制MCF-7细胞迁移率和侵袭率分别为76%和79%；TMC0.5μmol/L诱导MCF-7细胞早期凋亡和晚期凋亡的比率分别为21%和34%；Western blotting检测TMC对凋亡相关蛋白表达。结果显示：TMC可以显著降低Bcl-2表达量和Bad磷酸化水平,提高Bax表达量和cytochrome-c线粒体释放量,caspase-9和caspase-7被活化。以上结果表明,TMC通过调控Bcl-2家族,依赖线粒体/细胞色素c介导的凋亡信号激活下游caspase级联通路,最终诱导MCF-7细胞凋亡。(3)采用MTT、流式细胞术和Western blotting等方法,检测TMC对耐阿霉素乳腺癌细胞MCF-7/ADR细胞增殖等影响。结果显示：TMC抑制MCF-7/ADR细胞生长的ICso值为1.26μmol/L; TMC1μmol/L诱导MCF-7细胞早期凋亡和晚期凋亡的比率分别为17.2%和28.4%；TMC同样可以显著降低Bcl-2蛋白表达量,激活caspase-9和caspase-7o以上结果表明,TMC对MCF-7/ADR细胞同样敏感,并通过依赖线粒体/细胞色素c介导凋亡通路诱导MCF-7/ADR细胞凋亡。(4)采用Western blotting、双荧光素酶报告基因等实验检测TMC对MAPK (ERK、p-38和JNK)、Wnt、p53和Akt信号通路相关蛋白磷酸化和转录因子活性的影响。发现TMC可以显著降低Akt及其下游调控蛋白FKHR的磷酸化,并且0.4μmol/L TMC使Akt下游调控的转录因子CREB转录活性降低70%；TMC同时可以显著抑制上游直接调控Akt的PDK1激酶磷酸化,但是对EGFR和HER2酪氨酸激酶受体磷酸化无显著影响。进一步观察转染Akt持续激活质粒myr-Akt对TMC抑制MCF-7增殖的影响。结果显示：0.5μmol/L TMC对转染空载体和myr-Akt质粒的MCF-7细胞的增殖抑制率分别为64%和31%。以上结果表明,TMC通过阻断MCF-7细胞中Akt信号通路,从而调控下游细胞生存和凋亡相关蛋白及转录因子活性。(5)通过siRNA技术将PP1基因沉默,检测对Akt磷酸化的影响。结果显示：PP1基因沉默并没有显著影响Akt激酶的磷酸化水平。以上结果进一步表明TMC抑制MCF-7细胞增殖与其抑制PP1活性无主要关联。(6)采用MTT、Western blotting和细胞转染等方法,检测TMC与Leptomycin B (LMB)联合用药是否具有协同效应及其机制。结果显示：LMB先加24h再加TMC共同作用协同效应较好,协同效应指数CI值为0.38-0.49；联合用药达到半数抑制时,TMC和LMB的用量分别为单独用药时的23.8%和17.7%；TMC和LMB联用可以增强TMC对Akt和FKHR等蛋白磷酸化的下调作用；LMB可以增强TMC诱导的FKHR细胞核聚集。以上结果表明,TMC与LMB联用对抑制MCF-7细胞增殖具有显著协同效应,协同效应与LMB促进TMC诱导的FKHR细胞核聚集有关联。综上,论文研究发现TMC的抗肿瘤活性与PP1抑制活性之间的相关性较低；阐明了TMC诱导MCF-7细胞凋亡的机制；证明Akt和FKHR抑制剂类药物与核输出抑制剂联用具有协同效应。研究工作为TMC药物机制提供了新的例证,为进一步确定TMC抗肿瘤的直接作用靶点奠定了基础；同时,为TMC联合用药提供了一个新的设计思路。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-14
引言  14-15
1 文献综述  15-34
  1.1 TMC的研究进展  15-19
    1.1.1 TMC简介  15
    1.1.2 TMC的生物合成机制  15-17
    1.1.3 TMC的生物活性  17-19
  1.2 蛋白磷酸酶的研究进展  19-23
    1.2.1 蛋白磷酸酶PP1  19-20
    1.2.2 蛋白磷酸酶PP2A  20-21
    1.2.3 蛋白磷酸酶PP5  21-22
    1.2.4 蛋白磷酸酶抑制剂的致癌与抗癌活性  22-23
  1.3 细胞周期与细胞凋亡  23-29
    1.3.1 细胞周期概述  23-24
    1.3.2 细胞周期的分子基础与调控  24-26
    1.3.3 细胞周期与肿瘤发生  26
    1.3.4 细胞凋亡概述  26-27
    1.3.5 细胞凋亡的信号转导通路  27-29
  1.4 课题相关细胞信号通路  29-33
    1.4.1 PI3K/Akt信号转导通路  29-31
    1.4.2 MAPK信号转导通路  31
    1.4.3 Wnt与p53信号转导通路  31-33
  1.5 本文主要研究内容与思路  33-34
2 TMC对肿瘤细胞的生长抑制作用与抑制PP1的关系  34-56
  2.1 引言  34-35
  2.2 实验材料与设备  35-37
    2.2.1 实验材料  35
    2.2.2 实验试剂  35-36
    2.2.3 实验设备  36
    2.2.4 试剂配制  36-37
  2.3 实验方法  37-44
    2.3.1 质粒提取  37-38
    2.3.2 DNA片段纯化回收  38
    2.3.3 感受态细胞制备及转化  38-39
    2.3.4 磷酸酶PP1原核表达载体构建  39-40
    2.3.5 重组PP1菌株的诱导表达  40-41
    2.3.6 重组PP1的分离纯化  41
    2.3.7 SDS-PAGE电泳  41-42
    2.3.8 Western Blotting检测方法  42
    2.3.9 蛋白磷酸酶PP1活性测定  42-43
    2.3.10 MTT与MTS法检测细胞增殖  43-44
    2.3.11 ELISA法检测细胞IL-2表达量  44
    2.3.12 统计学分析  44
  2.4 实验结果  44-54
    2.4.1 磷酸酶PP1原核表达载体构建  44-46
    2.4.2 重组PP1的分离纯化  46-48
    2.4.3 TMC及其衍生物的结构  48-49
    2.4.4 TMC及其衍生物的PP1抑制活性  49-50
    2.4.5 TMC及其衍生物的肿瘤细胞生长抑制活性  50
    2.4.6 TMC及其衍生物的免疫抑制活性  50-52
    2.4.7 TMC的肿瘤细胞生长抑制活性与细胞内PP1活性的关联  52-54
  2.5 讨论  54-55
  2.6 小结  55-56
3 TMC对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响  56-77
  3.1 引言  56
  3.2 实验材料与设备  56-58
    3.2.1 实验材料  56-57
    3.2.2 实验试剂  57
    3.2.3 实验设备  57-58
    3.2.4 试剂配制  58
  3.3 实验方法  58-64
    3.3.1 细胞增殖检测  58-59
    3.3.2 细胞凋亡检测  59
    3.3.3 细胞划痕实验  59-60
    3.3.4 Transwell细胞迁移检测  60
    3.3.5 Transwell细胞侵袭检测  60-61
    3.3.6 Western blotting检测信号蛋白表达  61-63
    3.3.7 Caspase抑制剂阻断凋亡实验  63
    3.3.8 统计学分析  63-64
  3.4 实验结果  64-75
    3.4.1 TMC对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用  64-65
    3.4.2 TMC对乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭的影响  65-67
    3.4.3 TMC诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡  67-68
    3.4.4 TMC对细胞周期相关蛋白表达的影响  68
    3.4.5 TMC对Bcl-2家族蛋白表达的影响  68-69
    3.4.6 TMC对caspase级联蛋白表达的影响  69-70
    3.4.7 TMC抑制MCF-7细胞生长依赖caspase激活  70-71
    3.4.8 TMC对耐药细胞MCF-7/ADR细胞增殖和凋亡的影响  71-73
    3.4.9 TMC对Bcl-2和cytochrome-c蛋白表达的影响  73-74
    3.4.10 TMC对MCF-7/ADR细胞caspase活性的影响  74-75
  3.5 讨论  75-76
  3.6 小结  76-77
4 TMC对MCF-7细胞凋亡上游信号通路的影响  77-95
  4.1 引言  77
  4.2 实验材料与设备  77-79
    4.2.1 实验材料  77-78
    4.2.2 实验试剂  78
    4.2.3 实验设备  78-79
    4.2.4 试剂配制  79
  4.3 实验方法  79-84
    4.3.1 信号蛋白表达量及磷酸化检测  79
    4.3.2 转录因子转录活性检测  79-80
    4.3.3 Akt真核表达质粒转染  80-81
    4.3.4 蛋白磷酸酶PP1基因沉默  81-82
    4.3.5 TMC作用靶点生物信息学预测  82-83
    4.3.6 二氢叶酸还原酶活性测定  83
    4.3.7 统计学分析  83-84
  4.4 实验结果  84-92
    4.4.1 TMC对MAPK信号通路的影响  84-85
    4.4.2 TMC对Wnt和p53信号通路的影响  85-87
    4.4.3 TMC对Akt信号通路的影响  87-89
    4.4.4 Akt激活质粒过表达对TMC活性的影响  89-90
    4.4.5 PP1基因沉默对Akt磷酸化的影响  90
    4.4.6 TMC作用靶点的生物信息学分析  90-91
    4.4.7 生物信息预测靶点的实验验证  91-92
  4.5 讨论  92-94
  4.6 小结  94-95
5 TMC与Leptomycin B联用对MCF-7细胞增殖的协同抑制作用  95-109
  5.1 引言  95-96
  5.2 实验材料与设备  96-97
    5.2.1 实验材料  96
    5.2.2 实验试剂  96
    5.2.3 实验设备  96-97
    5.2.4 试剂配制  97
  5.3 实验方法  97-101
    5.3.1 细胞总RNA提取  97
    5.3.2 FKHR真核表达载体构建  97-99
    5.3.3 联合用药协同效应测定方法  99-100
    5.3.4 Western blotting检测信号蛋白表达  100
    5.3.5 GFP-FKHR真核表达质粒转染  100-101
    5.3.6 统计学分析  101
  5.4 实验结果  101-107
    5.4.1 TMC与LMB联用抑制MCF-7细胞增殖的协同效应  101-102
    5.4.2 TMC与LMB联用对Bcl-2家族蛋白表达影响  102-103
    5.4.3 TMC与LMB联用对Akt和FKHR磷酸化的影响  103-104
    5.4.4 FKHR-GFP真核表达质粒构建  104-106
    5.4.5 TMC与LMB联用对FKHR细胞核定位的协同作用  106-107
  5.5 讨论  107-108
  5.6 小结  108-109
6 结论与展望  109-111
  6.1 结论  109-110
  6.2 创新点摘要  110
  6.3 展望  110-111
参考文献  111-120
附录 缩略词表  120-121
攻读博士学位期间发表学术论文情况  121-122
致谢  122-123
作者简介  123-124

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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