学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

富组蛋白1促进人表皮细胞，人成纤维细胞增殖和迁移在创伤愈合中的作用及机制研究

作　者: 蒋艳
导　师: 王仙园; 罗向东
学　校: 第三军医大学
专　业: 护理学
关键词: 人表皮细胞人成纤维细胞富组蛋白1 创伤
分类号: R641
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
下　载: 269次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

研究背景口腔黏膜创伤较皮肤创伤愈合速度快，瘢痕少，是一种理想的愈合形式，此现象归因于口腔黏膜本身的组织结构特点以及特殊的唾液环境。近来研究发现唾液中的抗菌肽成分——富组蛋白能够促进口腔黏膜上皮细胞迁移，是口腔黏膜创伤愈合的主要影响因子。抗菌肽属天然免疫防御系统成员，目前研究发现其某些成员具有抵抗病原微生物以及促创伤愈合的双重功能，是一类极具应用前景的新型创伤治疗药物。由于特异性表达于人类及灵长类动物唾液，富组蛋白能否影响皮肤创伤愈合尚不清楚，研究甚少。研究目的本研究以皮肤创伤愈合相关细胞：人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株为研究对象，考察富组蛋白1（Histatin1，Hst1）对两者增殖和迁移功能的影响，并初步探讨其作用机制，旨在探明唾液特有抗菌肽Hst1对非口腔黏膜细胞的有无影响，能否促进皮肤创伤愈合，为促进皮肤创面愈合提供新的治疗思路。研究方法人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株按常规方法培养，取对数生长期细胞进行下述实验。1.采用细胞计数法、MTT比色法考察不同浓度（3～100μg/mL）Hst1于不同时相点（24h、48h、72h）对人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株增殖功能的影响，并对其与人重组表皮生长因子（rhEGF）的相互作用关系进行比较。通过流式细胞术检测不同作用时相点不同浓度Hst1对两种细胞周期的影响，初步探讨其促增殖机制。2.利用体外细胞划痕实验，考察不同时相点，丝裂霉素C（MMC）处理后或未处理时Hst1和（或）rhEGF对人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株划痕创伤愈合率的影响。3.采用MTT法、体外细胞划痕实验，考察EGFR，TGF RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4四种细胞表面受体抗体对Hst1作用下人表皮HaCaT细胞株、人成纤维细胞株增殖、迁移功能的影响。4.数据采用SPSS17.0统计软件进行方差分析，组间比较采用LSD-t检验或Dunnett’s T3检验。研究结果1.3μg/mL～100μg/mL Hst1能够促进HaCaT细胞增殖，且与浓度、时间呈依赖关系。（1）细胞培养后24h，仅10ng/mL rhEGF组、30μg/mL Hst1+10ng/mL rhEGF组细胞数高于对照组（t=3.813，5.410，P＜0.05或P＜0.01）。除培养后48h30μg/mL Hst1组、3μg/mL Hst1组外，其余各实验组培养细胞后48h、72h，细胞数均显著高于对照组（t值为7.754～24.979，P＜0.01）。培养后72h，100μg/mL Hst1组细胞数（19.21±0.59）×10~4个明显高于30μg/mL Hst1组（16.19±0.53）×10~4个以及3μg/mL Hst1组（15.38±0.13）×10~4个（t=11.391,19.017，P＜0.01），30μg/mL Hst1+10ng/mL rhEGF组细胞数（19.75±0.35）×10~4个高于30μg/mL Hst1组，3μg/mL Hst1组及10ng/mL rhEGF组(19.19±0.09)×10~4个（t值为4.579～34.884，P＜0.05或P＜0.01）。各浓度Hst1单独作用组培养细胞后24h～72h内，细胞数随时间延长而增加（t值为16.629～68.891，P＜0.01）。（2）细胞培养后24h～72h内，各浓度Hst1组OD值均高于同一时相点对照组（t值为3.160～15.576，P＜0.01或P＜0.05）。同一时相点不同浓度Hst1组OD值随浓度降低而下降，24h～72h内100μg/mL Hst1组OD值均显著高于3μg/mL Hst1组（t值为4.264～7.234，P＜0.01）。各浓度Hst1组细胞培养后72h、48hOD值均高于培养后24h同组内OD值（t值为6.219～22.308，P＜0.01）。（3）细胞培养后24h，48h，100μg/mL Hst1组（0.62±0.01，0.70±0.01）、30μg/mLHst1组（0.52±0.01，0.66±0.01）与对照组PI值(0.48±0.01，0.54±0.01)比较均显著提高（t值为4.752～16.10~4，P＜0.01）。细胞培养24h～72h内，除72h30μg/mL Hst1组与3μg/mL Hst1组PI值比较无统计学差异外（t=0.273, P＞0.05），各浓度Hst1处理组比较，随浓度增加PI值均明显提高（t值为3.690～17.459，P＜0.01）。同浓度Hst1处理组组内48h PI值较24h明显增加（t值为7.607～15.582，P＜0.01），72h较48h则明显降低（t值为-29.672～-18.657，P＜0.01）。2.30μg/mL Hst1能够促进HaCaT细胞划痕创伤愈合。MMC未处理时：细胞划痕加药处理后16h，30μg/mL Hst1组细胞愈合率（75.87±3.94）%显著高于对照组（52.98±3.50）%（t=12.241，P＜0.01），但低于30μg/mL Hst1+10ng/mL rhEGF组（94.98±4.08）%、15μg/mL Hst1+5ng/mL rhEGF（97.05±3.67）%、15μg/mL Hst1+10ng/mL rhEGF组（80.55±5.94）%（t值为-11.324～-2.502, P＜0.01或P＜0.05）。各组内划痕后24h与16h比较，细胞16h愈合率差异无统计学意义（t值为0.990～1.771，P＞0.05）。MMC处理后：划痕后16h，30μg/mL Hst1组细胞愈合率（59.89±3.41）%高于对照组（38.40±4.22）%（t=7.790，P＜0.01），但较MMC未处理时30μg/mL Hst1组明显下降（t=-10.863，P＜0.01）。Hst1与rhEGF联合应用组16h划痕愈合率与30μg/mL Hst1组比较无统计学差异(t值为0.0614～2.030，P＞0.05)。各组内划痕24h与16h比较，细胞愈合率差异无统计学意义（t值为0.925～1.750，P＞0.05）。3.3μg/mL～100μg/mL Hst1的Hst1能够促进人成纤维细胞增殖。（1）细胞培养后24h～72h内，各浓度Hst1组细胞数较同一时相点对照组均增长（t值为4.062～47.370，P＜0.01或P＜0.05）。细胞培养后24h，100μg/mL Hst1组细胞数（3.89±0.18）×10~4个较3μg/mL组(3.13±0.53)×10~4个提高（t=4.040，P＜0.05）；培养后48h，30μg/mL Hst1组(5.02±0.71)×10~4个，3μg/mL组(5.00±0.35)×10~4个细胞数较100μg/mL Hst1组(4.13±0.18)×10~4个提高（t=3.661，6.680，P＜0.05或P＜0.01）；培养后72h，30μg/mL Hst1组细胞数(12.37±0.18)×10~4个较100μg/mL Hst1组(9.50±0.71)×10~4个，3μg/mL组(10.13±1.24)×10~4个明显提高（t=11.808,5.349，P＜0.01）。各浓度Hst1组培养细胞后24h～72h内，细胞数随时间延长而增长（t值为2.854～30.055，P＜0.01或P＜0.05）。同一时相点，30μg/mL Hst1+10ng/mL rhEGF组较单一使用Hst1或rhEGF相比细胞数均显著增加（t值为3.857～20.045，P＜0.01）。（2）细胞培养后24h～72h内，各浓度Hst1组OD值均显著高于同一时相点对照组（t值为3.712～18.262，P＜0.01）。细胞培养后24h，100μg/mL Hst1组(0.50±0.02)较30μg/mL Hst1组(0.47±0.02)，30μg/mL Hst1组较3μg/mL Hst1组(0.42±0.03)OD值均显著增加（t=3.187,5.036，P＜0.01）；培养后48h各浓度组间OD值比较无统计学差异（t值为1.279～2.375，P＞0.05）；培养后72h，与30μg/mL Hst1组(0.79±0.04)比较，100μg/mL Hst1组(0.70±0.04)，3μg/mL组(0.62±0.03)OD值均明显降低（t=-6.484，-7.512，P＜0.01）。对照组及各浓度Hst1组同组内培养细胞后24h～72h内， OD值随时间延长显著增长（t值为4.298～25.956，P＜0.01）。（3）细胞培养后24h，100μg/mL Hst1组(0.16±0.01)、30μg/mL Hst1组(0.16±0.01)PI值高于对照组(0.12±0.01)（t=6.790，6.052，P＜0.01）。培养后48h，各浓度Hst1组PI值均高于对照组（t值为5.497～20.927，P＜0.01）；培养后72h，各浓度Hst1组PI值与对照组比较无统计学差异（F=2.583，P＞0.05）。细胞培养后24h，100μg/mL Hst1组PI值较30μg/mL Hst1组，30μg/mL Hst1组较3μg/mL Hst1组提高（t=7.662,5.828，P＜0.01或P＜0.05）。培养后48h，30μg/mL Hst1组PI值较100μg/mL Hst1组、3μg/mL Hst1组明显增加（t=11.875，15.430，P＜0.05）。培养后72h各浓度Hst1组间PI值比较无统计学差异（F=3.909，P＞0.05）。各浓度Hst1组培养后48h较培养后24h、72h组内PI值显著提高（t值为5.688～26.912，P＜0.01）4.30μg/mL Hst1能促进HF细胞划痕创面愈合。MMC未处理时：细胞划痕加药处理后8h，30μg/mL Hst1组划痕愈合率(37.50±2.22)%显著高于对照组(26.00±5.60)%（t=6.037，P＜0.01），低于15μg/mLHst1+10ng/mLrhEGF组愈合率(45.24±3.26)%（t=-6.170，P＜0.05）。MMC处理HF后，各实验组8h愈合率两两比较，无统计学差异（F=1.822，P＞0.05）。MMC处理或未处理相同成分及浓度对应组相比，各组8h愈合率显著下降（F值为-12.067～-5.824，P＜0.01）。随着时间延长，划痕愈合速度减慢，同组内16h与8h划痕愈合率差异均无统计学意义（F值为0.442～4.121，P＞0.05）。5. EGFR，TGF RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4四种受体抗体均能抑制Hst1对HaCaT细胞的增殖、迁移促进作用。细胞加抗体处理后24h～72h，各抗体组较30μg/mL Hst1组OD值下降（t值为3.424～34.583，P＜0.05或P＜0.01）。四种受体抗体处理细胞后细胞划痕愈合率降低，各抗体组16h愈合率[(41.15±0.95)%,(53.15±2.07)%,(46.24±2.51)%,(47.06±1.33)%]较30μg/mL Hst1组(71.02±2.42)%下降（t值为-36.333～-17.724，P＜0.01）。其中，EGFR抗体组16h愈合率显著低于其余三种受体抗体（t值为-16.644～-6.000，P＜0.01）。HaCaT细胞经MMC处理排除增殖后，各抗体组16h愈合率[(34.05±0.96)%,(45.76±2.02)%,(2.31±0.23)%,(4.75±0.36)%]较30μg/mL Hst1组(50.41±1.17)%下降，均具有统计学差异（t值为-127.235～-6.284，P＜0.01）。其中，Syndencan-1，Syndencan-4受体抗体组愈合率均显著低于其余两种受体抗体组（t值为-102.068～-63.082，P＜0.01）。6. Syndecan-4抗体能抑制Hst1对HF的增殖促进作用。细胞加抗体处理后24h～72h，Syndecan-4抗体组OD值（[0.37±0.03），（0.53±0.03），（0.64±0.03）]较30μg/mL Hst1组[（0.50±0.02），（0.65±0.03），（0.72±0.04）]显著下降（t值为2.868～11.462，P＜0.01）。细胞加四种受体抗体后Syndecan-4抗体组（21.83±2.19）%较30μg/mL Hst1组16h细胞划痕愈合率（31.23±2.66）%显著降低（t=7.132，P＜0.01），且低于其余三种抗体组愈合率（t值为5.209～5.315，P＜0.01）。随着时间延长，划痕愈合速度减慢，同组内16h与8h划痕愈合率差异均无统计学意义（t值为0.184～1.242，P＞0.05）。研究结论1. Hst1能够促进HaCaT细胞增殖和迁移，其促增殖作用与浓度、时间呈依赖关系。Hst1与rhEGF联合应用时对HaCaT细胞增殖和划痕创伤愈合具有协同促进作用，而对迁移功能无明显协同作用。2. Hst1能够促进人成纤维细胞增殖，但促迁移功能不明显。Hst1与rhEGF联合使用时对人成纤维细胞增殖和划痕创伤愈合具有协同促进作用。3. EGFR，TGF RⅡ，Syndencan-1及Syndencan-4可能均与Hst1促进HaCaT细胞增殖、迁移有关，其中，Syndencan-1，Syndencan-4与Hst1促HaCaT细胞迁移明显相关。4. Syndencan-4与Hst1促进人成纤维细胞增殖相关。

全文目录

相似论文

中图分类: > 医药、卫生 > 外科学 > 创伤外科学 > 创伤
© 2012 www.xueweilunwen.com