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依硫磷酸通过抑制细胞周期进程抗白血病作用的实验研究
作 者: 张文英
导 师: 朱宏丽
学 校:
专 业: 血液病学
关键词: 依硫磷酸 白血病 生物信息学 细胞周期 细胞增殖
分类号: R733.7
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
目的:依硫磷酸是在肿瘤放化疗过程中最常用的泛细胞保护剂。前期研究表明,依硫磷酸在保护正常细胞的同时不会降低放化疗的抗肿瘤作用。随着研究的深入,发现依硫磷酸具有多方面的药理作用,主要包括类造血细胞生长因子作用、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制细胞周期进程的作用。目前,有关依硫磷酸对白血病细胞生物学活性的影响尚不明确。为此,本研究以人类白血病K562细胞为对象,基于生物信息学预测结果,研究了依硫磷酸对白血病细胞增殖和周期的影响及相关分子机制。方法:1.生物信息学预测与分析:以依硫磷酸,Amifostine, Ethyl, WR-2721为关键词,在人类基因表达数据库和蛋白质组学数据库中搜索相关的基因和蛋白表达信息,通过芯片数据库分析方法筛选差异表达基因,再用DAVID2.0软件进行聚类分析。2.采用0.35mg/ml、0.75mg/ml、1.5mg/ml浓度的依硫磷酸处理K562细胞12h、24h和48h,倒置显微镜观察细胞形态改变,CCK-8法检测K562的增殖,碘化丙啶(PI)染色流式细胞术检测细胞周期变化,荧光实时定量PCR法(real-time quantitive PCR, RT qPCR)检测细胞周期相关基因CyclinA2、CyclinB1、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6的mRNA表达水平变化。免疫印迹法(Western blot)验证CyclinD1蛋白表达。结果:1.依硫磷酸对全基因组中约5%的基因具有表达调控作用。460条差异基因中有139条为已知基因,其中77条表达上调,62条表达下调;13条为依硫磷酸处理后新表达的基因,5条为依硫磷酸处理后表达完全受抑的基因。聚类分析表明,差异表达的139个基因中分属11大类,主要与细胞周期、造血及免疫调控和凋亡等生物学功能相关。2.依硫磷酸处理K562细胞后,细胞开始聚集成团、体积大小不一,折光性差,胞浆颗粒感明显,随着药物处理时间延长及浓度增加,细胞皱缩,核碎裂明显。3. CCK-8检测表明,0.35mg/ml、0.75mg/ml、1.5mg/ml浓度的依硫磷酸对K562细胞增殖具有抑制作用。0.35mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h的抑制率分别为14.4%、15.8%和28.6%;0.75mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h的抑制率分别为31.1%、48.9%和66.7%;1.5mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h的抑制率分别为83.7%、95.8%和99.2%。依硫磷酸抑制K562细胞增殖呈剂量和时间依赖性,其中处理24h的半数抑制浓度(50%Inhibiting concentration, IC50)为0.64mg/ml。4.细胞周期检测表明,与空白对照组相比,依硫磷酸处理组的G1期细胞比例增加(p<0.05),且这种作用呈剂量和时间依赖性。0.35mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h时G1期细胞比例分别为32.9%、44.0%和43.0%;0.75mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h时G1期细胞比例分别为38.5%、46.1%和40.9%;1.5mg/ml依硫磷酸处理12h、24h和48h时G1期细胞比例分别为41.7%、47.8%和47.2%。5. RT qPCR检测表明,依硫磷酸处理24h,与空白对照组相比,CyclinA2、Cyclin B1和Cyclin D1的mRNA表达下降(p<0.05),对Cyclin E1表达影响不显著,而CDK2、CDK4和CDK6的mRNA表达均有不同程度升高(p<0.05);其中,对Cyclin D1和CDK6的mRNA表达影响呈浓度依赖性。免疫印迹法证实依硫磷酸处理后CyclinD1蛋白表达下调。结论:依硫磷酸具有抑制白血病细胞系K562增殖的作用,且这种作用部分是通过下调细胞周期相关蛋白的表达将细胞阻滞于G1/S期而实现。
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全文目录
中文摘要 5-7 英文摘要 7-9 第一部分:依硫磷酸调控白血病 K562 细胞基因表达谱的生物信息学预测 9-26 前言 9-13 材料方法 13-15 结果 15-18 讨论 18-22 参考文献 22-26 第二部分:依硫磷酸通过抑制细胞周期进程抗白血病作用的实验研究 26-52 前言 26-28 材料方法 28-38 结果 38-44 讨论 44-49 结论 49-50 参考文献 50-52 综述 52-59 参考文献 57-59 攻读硕士研究生期间发表文章 59-60 致谢 60-61
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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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