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Sirt3对AngⅡ诱导的小鼠血管平滑肌细胞增殖的作用研究

作　者: 吴新宁
导　师: 卜培莉
学　校: 山东大学
专　业: 内科学
关键词: 沉默信号调节因子3 血管紧张素Ⅱ 血管平滑肌细胞增殖
分类号: R541.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CHD)是严重危害全人类健康的常见病和多发病,全世界每年约有2千万人死于各种急性心血管事件,其中有一半以上是由冠状动脉粥样硬化性心脏病引起的。冠状动脉粥样硬化性心脏病占冠心病的90%以上,是冠心病的最主要原因。近年来,随着人们生活水平的提高、饮食习惯的改变以及生活节奏的加快,冠心病己突出表现出年轻化、高发病率、高致残率和高死亡率的特点。因此,冠心病的预防和早期诊断治疗工作已刻不容缓,不得不引起世界各国的共同关注。掌握冠心病的发病环节和致病机理是我们预防和早期诊断治疗的基础。血管平滑肌细胞是血管中层的主要细胞,研究显示血管平滑肌细胞在病理性刺激作用下,可以从收缩表型迅速调整为增殖表型,细胞功能也从调节血管张力转变为具有增殖、迁移、分泌能力,血管平滑肌细胞的这种表型转换在冠心病、冠状动脉支架成形术后再狭窄的发生、发展中具有重要作用。沉默信息调节因子(silent mating type information regulation2, Sir2)家族是在研究酵母菌转录沉默时发现的广泛存在于各种物种的基因,在NAD+的参与下能够调节组蛋白的乙酰化状态,研究显示在基因沉默、染色质稳定、双链DNA断裂损伤后生理修复以及延长细胞周期中均起着重要的作用。在哺乳动物共有7个Sirt同源基因,分别命名为Sirtl-7。沉默信息调节因子3(Sirt3)是第一个被定位在哺乳动物细胞线粒体的NAD+依赖的去乙酰化酶家族成员,其基因的激活已被证实与延长人类寿命有关。Sirt3广泛存在于线粒体基质和细胞核中,其组织器官分布也非常广泛,在脑、肝脏、脾脏、睾丸、骨骼肌、肾脏、心脏、胸腺、肺、骨髓、子宫和卵巢等器官中均检测到其mRNA的表达,在物质代谢活跃的组织如肌肉、肝脏、肾脏和心脏中高表达。近年研究报道SIRT3过表达对多种刺激下的心肌细胞具有保护作用,外源性的NAD+通过激活Sirf3-LKBl-AMPK通路能够抑制激动剂诱导的心肌重构。Sirt3在血管组织中是否表达及其在血管中是否具有类似于其在心脏中的保护作用至今未见文献报道。目的(1)检测Sirt3在小鼠血管平滑肌细胞中是否表达。(2)探讨Sirt3在小鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法1.细胞培养C57小鼠血管平滑肌细胞株由山东大学齐鲁医院心血管重构与功能研究重点实验室惠赠。培养基由DMEM、10%胎牛血清、1%双联抗生素配制。细胞在37℃、5%C02培养箱中常规培养。用浓度梯度血管紧张素Ⅱ (10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L)刺激细胞,复制细胞增殖模型。2.实时定量PCR技术收集细胞,通过总RNA的提取,逆转录,实时定量PCR等步骤检测各组中Sirt3在mRNA水平的表达。3. Western blot通过提取细胞总蛋白,凝胶电泳,转膜,标记一抗、二抗,显色等步骤检测Sirt3在各组中蛋白水平的表达。4. Sirt3-siRNA和Sirt3-质粒转染Sirt3-siRNA和Sirt3-质粒均由试剂公司合成。Sirt3-预先经PCR筛选出抑制率最好的序列；Sirt3-质粒在大肠杆菌中扩增抽提并送公司鉴定。以脂质体LipofectamineTM2000分别转染Sirt3iRNA和Sirt3-质粒,通过沉默或过表达Sirt3-检测Sirt3对小鼠血管平滑肌增殖的作用。5.Edu检测细胞增殖通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(Edu)试剂盒检测各组细胞增殖水平。6.统计学分析各组实验数据均用均数±标准差(x±s)表示,实验组与对照组比较用t检验,三个实验组总体比较采用One-way ANOVA分析,均数间的两两比较用SNK法,P<0.05为统计学意义显著标准。结果1.Western blot预实验证实了小鼠血管平滑肌细胞中有Sirt3蛋白的表达。2.实时定量PCR数据经计算统计分析,AngⅡ10-7mol/L、AngⅡ10-6mol/L、 AngⅡ10-5mol/L三组Sirt3mRNA的相对表达量均显著高于对照组(P<0.01),其中AngⅡ10-6mol/L组的Sirt3mRNA的表达高于AngⅡ10-7mol/L和AngⅡ10-1mol/L组(P<0.05), AngⅡ10-7mol/L组与AngⅡ10-5mol/L组相比无显著性差异。3. Western blot结果显示三个AngⅡ组Sirt3蛋白的表达量均明显高于对照组(P<0.01), AngⅡ10-6mol/L组Sirt3蛋白的表达量高于AngⅡ10-7mol/L和AngⅡ10-5mol/L组(P<0.05),而AngⅡ10-7mol/L组与AngⅡ10-5mol/L组相比差异无显著性。4.Sirt3-siRNA和Sirt3-质粒转染后各组Sirt3的表达情况用western blot检测,结果显示抑制序列转染后Sirt3蛋白表达明显降低(P<0.01), Sirt3质粒转染后Sirt3蛋白表达明显升高(P<0.01)。5.Edu试剂盒检测各组细胞增殖水平,可知AngⅡ组(10-6mol/L)较对照组升高有显著性(P<0.05), AngⅡ+Sirt3-siRNA组较AngⅡ组升高更显著(P<0.05), AngⅡ+Sirt3-质粒组与AngⅡ组相比明显降低(P<0.05)结论1) Sirt3在小鼠血管中膜平滑肌细胞中稳定表达。2) AngⅡ刺激可使Sirt3在mRNA水平和蛋白水平表达量均明显升高。3) AngⅡ可复制小鼠血管平滑肌细胞增殖模型,沉默Sirt3导致细胞对AngH这种病理性刺激的耐受性降低。4) Sirt3过表达可抑制AngⅡ诱导的VSMCs增殖。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
符号说明  13-15
前言  15-16
材料与方法  16-31
结果  31-33
讨论  33-37
结论  37-38
本研究的创新性与局限性  38-39
附图表  39-49
参考文献  49-54
致谢  54-55
攻读硕士学位论文期间发表的论文  55-56
附件  56

Sirt3对AngⅡ诱导的小鼠血管平滑肌细胞增殖的作用研究

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