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乙醛脱氢酶2基因Glu504Lys多态与急性冠脉综合征的关系及其机制研究

作　者: 徐峰
导　师: 陈玉国
学　校: 山东大学
专　业: 急诊医学
关键词: 急性冠脉综合征乙醛脱氢酶2 基因多态易感基因机制
分类号: R541.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景急性冠脉综合征(acute coronary syndrome, ACS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic disease, CAD)的主要临床亚型,包括不稳定性心绞痛、非ST段抬高型心肌梗死(non-ST-segment elevation myocardial infarction, NSTEMI)和ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction, STEMI),该亚型的发生和发展是CAD致残和致死的主要原因之一。随着时代的发展,ACS的防治策略已经从最初的终末期治疗转向早期诊断和早期预防,相关研究也已经从改变生活方式和饮食习惯等整体层面发展到分子、基因水平。以往研究发现,乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase2, ALDH2)是人体内酒精(乙醇)代谢的关键酶之一,酒精首先在乙醇脱氢酶作用下代谢为乙醛,再经过ALDH代谢为乙酸,排出体外。ALDH2基因第12外显子内存在一个单核苷酸多态(single nucleotide polymorphisms, SNPs)——rs671,出现碱基置换：鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A),故导致密码子改变：GAA→AAA,进而发生该酶第504个氨基酸的改变,谷氨酸(Glu)→赖氨酸(Lys)。所以,ALDH2有两个等位基因：野生型(ALDH2*1,*504Glu),突变型(ALDH2*2,*504Lys)。并且,研究也证实,这一SNPs导致ALDH2活性发生显著改变,且这一SNPs存在明显的种族差异,其在欧美白种人中少见,而在中、日、韩等东亚黄种人中突变率高达30%-50%,即全世界大约有6%的人携带ALDH2突变基因。早期关于ALDH2基因Glu504Lys多态与疾病的研究,往往关注该基因与肝炎、肝硬化、消化系统肿瘤、酒精性心肌病等酒精相关性疾病和恶性肿瘤等的关系。随着研究的进展,近年来,该多态与心血管疾病的关系开始引起了研究者们的注意。一项横断面研究表明,在日本人中ALDH2Glu504Lys多态与心肌梗死(myocardial infarction, MI)相关,我们早期的一项研究和一项韩国人群的研究也得到了相似的结果。并且,近期《science》的一篇研究提示,ALDH2在心肌缺血保护中发挥了重要作用,该研究发现,不同基因型ALDH2活性存在显著差异,表达不同活性ALDH2的心脏缺血后所造成的心肌损伤程度差异显著,提高ALDH2活性可明显降低心肌缺血后的损伤面积。该研究结论提示,携带突变型ALDH2的ACS患者心肌缺血坏死时损伤更为严重,可能预后不良。但是,另有一项日本人群的研究却提示,ALDH2基因突变型可能是动脉粥样硬化的保护因素。上述研究结果似乎矛盾,令人迷惑。因此,本课题拟在中国汉族人群中,通过较大样本的病例对照研究进一步明确ALDH2Glu504Lys多态性与ACS发生的相关性,并从多个角度探讨该多态影响ACS发生的可能机制,以及通过前瞻性队列研究探讨该多态对ACS患者预后的影响。至本课题完成前,国际上尚罕见上述三方面研究。在过去30年里,许多研究证实饮酒与MI、心绞痛发生密切相关,因此,ALDH2作为酒精代谢的关键酶之一,其Glu504Lys多态影响ACS发生的机制是否受饮酒影响?此外,近年研究证实,人类ALDH2不仅是乙醇代谢的关键酶,而且是硝酸甘油转化成一氧化氮的关键酶。动物实验也证实,抑制ALDH2活性可显著降低硝酸甘油引起的犬冠状动脉扩张。故有学者推测ALDH2突变基因影响ACS发生也可能与冠状动脉痉挛相关。而既往研究已证实,ACS发生的关键机制是炎症诱发的易损斑块破裂和血栓形成。最近有研究提示,ALDH2可显著影响氧化应激,而炎症又与氧化应激存在着十分密切的联系。另外,以往也有研究提示,内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)与ACS的发生发展密切相关。因此,本研究拟初步探讨,在ALDH2基因Glu504Lys多态影响ACS发生机制方面,饮酒、血管舒张功能、冠状动脉病变严重程度、炎症、EPCs等多种因素是否发挥作用。ACS是目前我国致残和致死率最高的疾病之一,基于中国汉族ALDH2基因*504Lys突变30%-50%的高发生率,开展该基因多态与ACS的相关性及其机制研究,将对我国ACS防治新策略的制订提供重要的依据,对促进我国ACS防治工作意义显著。目的本课题研究目的：①在山东汉族人群中,通过较大样本的病例对照研究进一步明确ALDH2Glu504Lys多态性与ACS发生的相关性；②探讨饮酒、血管舒张功能、冠状动脉病变严重程度、炎症、EPCs等多种因素是否参与ALDH2Glu504Lys多态影响汉族人群ACS发生的机制；③在山东汉族人群中,通过前瞻性队列研究探讨ALDH2Glu504Lys多态对ACS患者预后的影响。方法1.研究对象病例对照研究中,病例组选择2007年9月至2008年12月期间于本院行冠状动脉造影的山东汉族AC8患者为研究对象,对照组来自山东大学齐鲁医院健康体检中心以及与病例组同时期行冠状动脉造影结果正常者。病例组和对照组的研究对象均再根据ALDH2基因Glu504Lys多态性再次分组：野生型组和突变组。携带ALDH2*1/*1基因型者为野生型组,携带ALDH2*1/*2与*2/*2者归于一组,即突变组。前瞻性队列研究以2007年1月至2009年7月期间于山东大学齐鲁医院急诊内科病房住院行冠状动脉造影的山东汉族ACS患者为研究对象,依据ALDH2基因型分为野生型组和突变组。2.临床基本资料采用设计好的固定的调查表格记录所有研究对象的临床资料。包括年龄、性别、高血压、糖尿病、吸烟、心血管疾病家族史、血脂水平、既往MI史、既往血运重建史、入院诊断、造影结果、用药情况、出院诊断等项目。其中血脂包括总胆固醇(Total cholesterol, TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)、甘油三酯(triglyceride, TG),各项生化指标均来自我院中心实验室检验结果。3.饮酒情况饮酒频率(平均每周饮酒的天数)和平均每日饮酒量的计算方法如参考文献所述。以半定量式问卷的形式记录研究对象自开始饮酒以来,饮酒频率和饮用普通啤酒、红酒和白酒的平均量。将平均每周饮酒频率≥1次定义为经常饮酒。将普通啤酒355ml、红酒118ml、白酒40ml定义为一单位’drink",因上述各规格酒精含量大致相同(约14g)。平均每日饮酒量由饮酒频率和每次饮酒量计算得出。4.基因型测定采集外周静脉血以测定ALDH2基因型。ALDH2基因多态性的测定同课题组以往采用的方法。简要来说,先从静脉血中提取出DNA,再用PCR扩增目的DNA片段,最后纯化PCR产物、测序。5.冠状动脉病变严重程度每例患者均接受了冠状动脉造影,每支主要血管至少2个投照体位。通过选择性冠状动脉血管造影确定冠状动脉的狭窄程度,狭窄≥50%被定义为有意义的血管狭窄。应用以下两个参数评价冠状动脉病变严重程度：(1)冠状动脉病变血管支数,(2)Gensini评分。6.血管舒张功能2007年9月至2008年1月,对166例ACS患者行高分辨率超声,测定内皮依赖性血管舒张功能(Flow-mediated dilation, FMD)及非内皮依赖性血管舒张功能(Non-Flow mediated dilation, NMD)。超声检查于冠状动脉造影后72小时内进行,检查前18小时停服血管扩张药。患者休息30min后行超声检查。具体步骤如下：患者取仰卧位,用高频探头(S12)分别测定研究对象在休息时(基线)、反应性充血及舌下含服药物如硝酸甘油后的肱动脉直径。每种状态重复测量三次,取平均值。FMD为血管直径从基线值到反应性充血的峰值的增长率,NMD为血管直径从基线值到硝酸甘油诱导血管扩张的峰值的增长率。7.病例组与对照组的炎症标记物所有病例组和对照组的研究对象通过高敏乳胶增强免疫比浊法来测定血清高敏C反应蛋白(High-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)。8.初发STEMI患者外周循环EPCs数对病例对照研究中所有初发STEMI患者,用FACS Calibur流式细胞仪测量外周循环CD34+KDR+EPCs数。首先,样品管血样中加入FITC标记的单克隆鼠抗人CD34抗体和PE标记的KDR,对照管血样中加入相应的鼠抗人同型对照抗体,避光条件下室温孵育20min。再将细胞进一步与红细胞裂解液一起孵育,用冷磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline, PBS)冲洗三次。最后样品管与对照管中分别加入PBS制成悬液,FACS Calibur流式细胞仪分析。对淋巴单核细胞群设门收集细胞数至少5万个,循环EPCs数表示为CD34+KDR+细胞与所有淋巴单核细胞的比值。9.随访以主要不良心血管事件(major adverse cardiac events, MACE)作为随访终点事件,包括心源性死亡、新发生的急性心肌梗死、再次血运重建、新发生的心力衰竭。10.统计学分析所有数值变量用均数±标准差或中位数及四分位数差表示；分类变量用频数和百分数表示。分析数值变量用t检验(hs-CRP值先做对数变换成为正态分布后再做分析)与Mann-Whitney非参数检验(用于甘油三酯、饮酒量、Gensini评分与EPCs),分析分类变量用χ2检验。logistic回归与线性回归分析用来检测ALDH2基因多态性与ACS、初发STEMI、冠状动脉病变严重程度、hs-CRP水平和循环EPCs数等的关系,校正年龄、性别、体重指数(BMI)、血脂水平(TC、 LDL-C、HDL-C、TG)、吸烟史、高血压、糖尿病和CAD家族史。呈偏态分布的数值变量先做对数变换再纳入回归分析。随访数据的生存分析采用Kaplan-Meier分析与Cox回归分析方法。双向检验P<0.05被认为有统计学意义,用SPSS软件进行统计学分析。结果1.基本临床特征病例对照研究共入选1092例研究对象,病例组546人,对照组546人。病例组中,122人为初发STEMI患者,以1：2选取对照进行初发STEMI亚组的分析。病例对照研究中,病例组BMI、高血压、糖尿病、CAD家族史比例均显著高于对照组,而TC、LDL-C、HDL-C显著低于对照组,经常饮酒的样本数和平均每日饮酒量均显著高于对照组。在初发STEMI亚组,高血压、CAD家族史比例均显著高于其对照组,而TC和HDL-C显著低于其对照组,经常饮酒的样本数和平均每日饮酒量较对照组有升高趋势,但未见统计学差异。前瞻性队列研究共入选377例ACS患者,野生型组229例,突变组148例,突变患者占全部患者的39.3%。两组各项基本临床指标如年龄、性别、BMI、血脂水平、吸烟史、高血压、糖尿病和CAD家族史、心肌梗死病史、冠状动脉血运重建史、本次入院时ACS诊断情况(STEMI、NSTEMI、不稳定性心绞痛)均无统计学差异。但是,突变组左主干病变例数显著高于野生型组,而其他造影及血运重建指标均无统计学差异,包括病变血管支数、行冠状动脉血运重建比例、PCI时处理血管支数、PCI后TIMI3级比例。2. ALDH2基因突变情况各研究人群的ALDH2基因型频率都符合Hardy-Weinberg遗传平衡。病例组携带ALDH2突变基因型者显著高于对照组(46.7%vs31.9%,P<0.001)。亚组分析显示,初发STEMI组携带ALDH2突变基因型者也显著高于其对照组(48.4%与32.9%,p=0.006)。3. ALDH2基因多态与饮酒在ACS患者及初发STEMI患者中,ALDH2基因野生型携带者的每日饮酒量和经常饮酒的例数(ACS:35.3%vs27,8%, P<0.001;初发STEMI:49.2%vs28.8%,P=0.034)均显著高于突变型携带者。4. ALDH2基因多态与ACS相关性二元logistic回归校正年龄、BMI、血脂、吸烟史、高血压、糖尿病和CAD家族史后显示,ALDH2基因突变是ACS的独立危险因素(比数比[odds ratio,OR]1.95,95%可信区间[confidence interval, CI]:1.31-2.92, P=0.001)。进一步将饮酒情况纳入分析模型后,二者相关性减弱但仍有统计学意义(OR1.82,95%CI：1.23-2.70,P=0.03)。初发STEMI亚组的logistic回归分析也得到了相似的结果：校正年龄、BMI、血脂、吸烟史、高血压、糖尿病和CAD家族史后显示,ALDH2基因突变是初发STEMI的独立危险因素(OR2.17,95%CI：1.30-3.62,P=0.003),纳入饮酒情况后,二者相关性减弱但仍有统计学意义(OR1.95,95%CI：1.18-3.22,P=0.009)。5. ALDH2基因多态与冠状动脉病变严重程度在546例ACS患者中,不同ALDH2基因型患者的Gensini评分与病变血管支数都没有明显差异；多元线性回归和logistic回归分析校正年龄、性别、BMI、脂质水平、吸烟史、高血压、糖尿病和CAD家族史后,ALDH2多态性与Gensini评分和病变血管支数均未见显著相关(P>0.05,P>0.05)。对全部ACS中326例无MI病史的不稳定性心绞痛患者的进一步分析也显示了相同的结果(P>0.05,P>0.05)。6. ALDH2基因多态与血管舒张功能在行超声检查的166例ACS患者中,安静状态下的肱动脉直径在不同基因型患者中没有显著差异；FMD也相似(突变型4.9±2.3%,野生型5.1±2.5%,P>0.05)。然而,ALDH2基因突变型患者的NMD比无突变患者显著降低(3.9±3.3%和10.5±3.8%,P<0.001)。7. ALDH2基因多态与hs-CRP水平病例组和对照组中,ALDH2基因突变型携带者比野生型携带者均有更高的hs-CRP水平。多元线性回归分析发现,校正年龄、性别、BMI、脂质水平、吸烟史、高血压和糖尿病后,病例组和对照组中,ALDH2基因突变与高水平hs-CRP均呈独立相关(P=0.002,P=0.009)。并且,在分析ALDH2基因多态性与ACS关系的logistic回归中,将hs-CRP水平作为独立变量纳入后降低了ALDH2基因突变型在回归模型中的重要性(OR1.17,95%CI：1.01-1.37,P=0.040)。8. ALDH2基因多态与循环EPCs数量在初发STEMI患者中,突变型患者的循环EPCs数显著低于野生型患者。另外,在初发STEMI患者中,ALDH2基因为突变型者的年龄比野生型有更小的倾向(P=0.055),而且,ALDH2基因野生型携带者比突变型携带者有更高的HDL-C和更低的TG水平。多元线性回归校正年龄、性别、BMI、脂质水平、吸烟史、高血压和糖尿病后显示,ALDH2基因突变型是循环EPCs数的独立危险因素(P=0.032)。并且,二元logistic回归分析发现,在传统的心血管危险因素和饮酒史基础上,再将hs-CRP和循环EPCs数作为独立变量纳入后,ALDH2基因型和初发STEMI之间无显著相关(P=0.516)。9.随访结果前瞻性队列研究的随访时间为24-55个月,平均38个月,失访率为4.8%。随访期间两组患者治疗CAD的主要药物(阿司匹林、氯吡格雷、调脂药物、B-受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂)应用情况无显著差异。随访期间,该研究人群MACE发生率为13.8%,全因死亡率9%,其中心源性死亡率8%。突变组MACE和心源性死亡发生率均显著高于野生型组(21.0%vs9.2%,P=0.002；12.2%vs5.2%,P=0.026)。10.生存分析Kaplan-Meier分析显示,ALDH2基因突变型患者累计无MACE事件生存率和无心源性死亡生存率均显著低于野生型患者。Cox回归分析发现,ALDH2基因突变是ACS患者发生MACE事件和心源性死亡的独立危险因素(风险比[relative risk, RR]2.443,95%CI:1.390-4.296, P=0.002; RR2.727,95%CI:1.303-5.708, P=0.008)。结论1.在山东汉族人群中,健康人群ALDH2基因*504Lys突变(*1/*2和*2/*2)的发生率约为30%,而ACS患者ALDH2基因突变的发生率接近50%,两者存在显著差异。2.在山东汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变显著影响饮酒量和饮酒频率。3.在山东汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变是ACS的独立遗传危险因素,其机制与该突变对饮酒的影响有关,但也存在饮酒以外的机制。4.在山东汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变也是初发STEMI的独立遗传危险因素,其影响存在饮酒以外的机制。5.在汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变影响ACS的机制与饮酒显著减少、hs-CRP水平增高和循环EPCs数降低有关。6.在汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变影响ACS的机制与FMD所反映的血管舒张功能以及冠状动脉病变严重程度(以冠状动脉病变血管支数和Gensini评分评价)无明显相关。7.在山东汉族人群中,ALDH2基因*504Lys突变是ACS患者预后不良(发生MACE事件和心源性死亡)的独立预测因素。

全文目录

中文摘要  8-16
ABSTRACT  16-25
符号说明  25-26
前言  26-36
  ALDH2基因Glu504Lys多态与冠心病关系研究进展  26-30
  本课题的研究目的  30
  参考文献  30-36
第一部分 ALDH2基因Glu504Lys多态与山东汉族ACS相关性研究  36-52
  资料与方法  37-42
  结果  42-43
  讨论  43-46
  结论  46-47
  附表  47-49
  参考文献  49-52
第二部分 ALDH2基因Glu504Lys多态影响ACS的可能机制  52-72
  资料与方法  52-56
  结果  56-57
  讨论  57-62
  结论  62-63
  附表  63-67
  附图  67-68
  参考文献  68-72
第三部分 ALDH2基因Glu504Lys多态与山东汉族ACS预后关系研究  72-84
  资料与方法  72-74
  结果  74-75
  讨论  75-77
  结论  77-78
  附表  78-80
  附图  80-81
  参考文献  81-84
致谢  84-85
攻读学位期间发表的学术论文目录  85-86
SCI论文Ⅰ  86-108
SCI论文Ⅱ  108-133
学位论文评阅及答辩情况表  133

乙醛脱氢酶2基因Glu504Lys多态与急性冠脉综合征的关系及其机制研究

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