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PLL接枝淀粉共聚物的制备及其作为基因载体的研究

作　者: 赵天勤
导　师: 曹献英; 杜杰
学　校: 海南大学
专　业: 生物化工
关键词: PLL 基因载体可溶性淀粉
分类号: R943
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

基因治疗作为一种新型的疾病治疗手段,以其高效、特异性、靶向性强等优点,激起许多学者的研究热情。作为基因治疗的工具,选择合适的基因载体尤为重要,非病毒基因载体以其毒性小、负载DNA量多、使用简单成为目前基因载体研究的目标。多聚赖氨酸(PLL)与DNA所形成的复合物不仅毒性较高,而且容易引起复合物自身的聚集和沉淀,影响DNA的稳定性。本研究用可溶性淀粉修饰PLL,探讨其细胞毒性和作为基因载体的转染性能。本研究包括三部分内容：第一部分通过还原胺化反应制备了不同接枝率的多聚-L-赖氨酸-淀粉(PLL-S)共聚物,并通过红外光谱以及核磁共振法对其进行了结构表征,凝胶渗透色谱法检测了PLL-S的分子量,激光粒度分析仪检测了其电位,测试了PLL修饰前后的缓冲能力。第二部分用琼脂糖凝胶电泳法研究了其结合DNA的能力和抗DNase I降解的能力,检测了其结合DNA前后的粒径及电位。第三部分通过MTT法检测了PLL修饰前后的细胞毒性,研究了其在293T细胞中转染质粒DNA及FAM-siRNA的能力,并研究了血清、转染时间、PLL-S与DNA质量比对转染质粒DNA荧光表达量的影响,研究了转染时间、PLL-S与FAM-siRNA质量比对转染FAM-siRNA荧光强度的影响,通过流式细胞仪检测了FAM-siRNA的转染效率。结果显示,制备的PLL-S共聚物接枝率分别为2.8%、4.3%、6.7%、8.5%、8.6%,数均分子量分别为60629、77028、137541、176580、182932,电位分别为23.7mv、21.6mv、19.6mv、16.9mv、12.6mv,粒径分别为365.4nm、356.3nm、327.3nm、311.9nm、299.4nm; PLL-S/DNA复合物的电位随着PLL-S与DNA的质量比的减小先增大后降低,但PLL-S/DNA复合物的粒径低于PLL-S共聚物；PLL-S的浓度对粒径有影响,随着浓度增大,其粒径逐渐减小,但降幅较小；PLL-S共聚物能结合DNA,能保护DNA免受DNase I的破坏,且细胞毒性达到了生物医学材料细胞毒性评价等级0级和1级标准,制备的共聚物是合格的；PLL-S共聚物转染质粒DNA的能力较FAM-siRNA低,接枝率为2.8%时,转染FAM-siRNA的转染效率高达90.15%。综上所述,在制备PLL-S过程中,随着淀粉比例的增加,其接枝率和分子量逐渐增大、电位和粒径逐渐降低。结合DNA后,DNA被压缩,PLL-S/DNA复合物的粒径降低,但电位先增大后降低。所制备的PLL-S共聚物能很好的结合DNA,能够在293T细胞中转染质粒DNA,但转染效果欠佳,能转染FAM-siRNA,且转染效率较好,表明转染试剂的分子量大小能影响转染效果。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
1 绪论  10-16
  1.1 脂质体  10-11
    1.1.1 脂质体的分类  10-11
    1.1.2 脂质体与细胞间的作用方式  11
  1.2 无机纳米粒子基因裁体  11-12
  1.3 天然高分子基因载体  12-13
    1.3.1 壳聚糖及其衍生物载体  12
    1.3.2 淀粉  12-13
  1.4 阳离子多聚物  13-15
    1.4.1 聚乙烯亚胺  13-14
    1.4.2 树突状聚合物  14
    1.4.3 聚赖氨酸  14-15
  1.5 本课题的研究意义及内容  15-16
2 PLL-S共聚物的制备及其结构表征  16-26
  2.1 实验材料及仪器  16
  2.2 实验方法  16-18
    2.2.1 PLL接枝淀粉共聚物的制备  16-17
    2.2.2 PLL接枝淀粉共聚物的红外(FTIR)检测  17
    2.2.3 PLL接枝淀粉共聚物的核磁共振(~1H-NMR)检测  17
    2.2.4 PLL接枝淀粉共聚物的分子量测定  17-18
    2.2.5 PLL接枝淀粉共聚物的电位及粒径测定  18
    2.2.6 PLL接枝淀粉共聚物的缓冲能力测试  18
  2.3 结果与讨论  18-25
    2.3.1 PLL接枝淀粉共聚物的红外分析  18-19
    2.3.2 PLL接枝淀粉共聚物的核磁共振(~1H-NMR)解析  19-21
    2.3.3 PLL接枝淀粉共聚物的电位变化  21
    2.3.4 浓度对PLL-S共聚物的粒径影响  21-22
    2.3.5 PLL-S共聚物的分子量变化  22-24
    2.3.6 PLL-S共聚物的缓冲能力分析  24-25
  2.4 小结  25-26
3 PLL-S共聚物结合DNA的能力及其抗DNase Ⅰ降解的研究  26-34
  3.1 实验材料与仪器  26
  3.2 实验方法  26-28
    3.2.1 相关试剂配制  26
    3.2.2 感受态细胞的转化  26-27
    3.2.3 质粒DNA提取  27
    3.2.4 PLL-S/DNA复合物琼脂糖凝胶电泳阻滞实验  27-28
    3.2.5 PLL-S/DNA复合物抗DNase Ⅰ降解试验  28
    3.2.6 PLL-S/DNA的电位及粒径测定  28
  3.3 结果与讨论  28-33
    3.3.1 不同接枝率的PLL-S共聚物结合DNA能力分析  28-30
    3.3.2 PLL-S/DNA复合物抗DNase Ⅰ降解分析  30-31
    3.3.3 PLL-S/DNA复合物的电位分析  31-32
    3.3.4 PLL-S共聚物结合DNA前后粒径变化  32-33
  3.4 小结  33-34
4 PLL-S共聚物的细胞毒性评价及其在293T细胞中的转染  34-47
  4.1 实验材料与仪器  34-35
  4.2 实验方法  35-38
    4.2.1 细胞培养相关试剂的配制  35
    4.2.2 细胞培养  35-36
      4.2.2.1 293T细胞的复苏  35-36
      4.2.2.2 293T细胞的传代  36
      4.2.2.3 细胞的冻存  36
    4.2.3 不同接枝率的PLL-S共聚物的细胞毒性检测  36-37
    4.2.4 FAM-siRNA的溶解与保存  37
    4.2.5 PLL-S1共聚物体外质粒DNA转染  37-38
      4.2.5.1 时间对质粒DNA转染的影响  37
      4.2.5.2 血清对质粒DNA转染的影响  37
      4.2.5.3 质量比对质粒DNA转染的影响  37-38
    4.2.6 PLL-S共聚物的体外FAM-siRNA转染  38
      4.2.6.1 质量比对FAM-siRNA转染的影响  38
      4.2.6.2 时间对FAM-siRNA转染的影响  38
      4.2.6.3 PLL-S共聚物体外FAM-siRNA转染效率测定  38
  4.3 结果与讨论  38-45
    4.3.1 不同接枝率的PLL-S共聚物的体外细胞毒性分析  38-41
    4.3.2 PLL-S共聚物体外转染质粒DNA分析  41-42
      4.3.2.1 转染时间的影响  41
      4.3.2.2 血清的影响  41-42
      4.3.2.3 PLL-S共聚物与DNA质量比的影响  42
    4.3.3 PLL-S共聚物体外转染FAM-siRNA分析  42-44
      4.3.3.1 PLL-S共聚物与FAM-siRNA质量比的影响  42-44
      4.3.3.2 转染时间的影响  44
    4.3.4 PLL-S共聚物体外FAM-siRNA转染效率分析  44-45
  4.4 小结  45-47
5 总结  47-48
参考文献  48-52
硕士期间发表的论文  52-53
致谢  53

PLL接枝淀粉共聚物的制备及其作为基因载体的研究

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