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Th17细胞和白介素-17在异基因造血干细胞移植aGVHD中的免疫调控研究

作　者: 蔡奕峰
导　师: 吴德沛; 刘海燕
学　校: 苏州大学
专　业: 血液病学
关键词: 造血干细胞移植 移植物抗宿主病 Th17细胞 IL-17 异基因造血干细胞移植 IL-6 IFN-γ 巨噬细胞
分类号: R457.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


一、Th17细胞和IL-17在清髓性异基因造血干细胞移植aGVHD中的作用目的：通过清髓性小鼠异基因造血干细胞移植模型，研究Th17细胞和IL-17在清髓性异基因造血干细胞移植后发生的急性移植物抗宿主病中的作用。方法：在实验中采用野生型（WT）C57BL/6（H-2b）小鼠和C57BL/6（H-2b）IL-17基因敲除(IL-17-/-)小鼠作为供体，采用BALB/C（H-2d）小鼠作为受体。本实验包括三部分。第一部分：受体小鼠接受清髓性预处理（全身照射8.5Gy），移植野生型（WT）小鼠1×107个去除T细胞骨髓细胞（TCD-BMCs）和WT小鼠1×106个Th17细胞，或移植WT小鼠1×107个TCD-BMCs和IL-17-/-小鼠1×106个CD4+IL-17-/-T细胞。移植后每天两次观察小鼠生存状态，每5天进行急性移植物抗宿主病（aGVHD）临床评估。收集小鼠肝脏、肺、肠和皮肤行H&E染色并进行病理组织学分析，了解aGVHD靶器官损伤程度，取小鼠脾脏细胞并进行嵌合度测定。第二部分：受体小鼠接受清髓性预处理（全身照射8.5Gy），移植WT小鼠1×107个BMCs和WT小鼠5×106个脾脏细胞（SCs）（WW组），或移植WT小鼠1×107个BMCs和IL-17-/-小鼠5×106个SCs（WK组），或移植IL-17-/-小鼠1×107个BMCs和IL-17-/-小鼠5×106个SCs（KK组）。移植后每天两次观察小鼠生存状态，每5天进行aGVHD临床评估。收集小鼠肝脏、肺、肠和皮肤行H&E染色并进行病理组织学分析，了解aGVHD靶器官损伤程度，取小鼠脾脏细胞并进行嵌合度测定。第三部分：受体小鼠接受清髓性预处理（全身照射8.5Gy），移植IL-17-/-小鼠1×107个BMCs和IL-17-/-小鼠5×106个SCs。然后将小鼠随机分为两组，一组经腹腔注射200μL/只PBS（KK+PBS组），另一组经腹腔注射2μg/只（200μL体积）小鼠重组IL-17（KK+IL-17组）。移植后每天两次观察小鼠生存状态，每5天进行aGVHD积分评估。收集小鼠肝脏、肺、肠和皮肤行H&E染色并进行病理组织学分析，了解aGVHD靶器官损伤程度，取小鼠脾脏细胞并进行嵌合度测定。结果：绝大多数Th17细胞受体小鼠在15天内死亡，40%的CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠生存超过15天，CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠生存时间明显比Th17细胞受体小鼠延长（P<0.05）。Th17细胞受体小鼠aGVHD评分高于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠，并且肝脏、肺、肠、皮肤病理损伤也比后者严重。受体小鼠达到供者完全嵌合。在WW组、WK组和KK组的比较中，60%的WW受体小鼠生存超过30天，30%生存超过50天；20%的WK受体小鼠生存超过50天；大多数KK受体小鼠在30天内死亡；WW组受体小鼠生存时间明显长于KK组受体小鼠（P<0.05）。WW组受体小鼠和WK组受体小鼠生存时间没有差别，WK组受体小鼠和KK组受体小鼠生存时间也没有差别。KK组小鼠aGVHD评分高于WW组小鼠，并且肝脏、肺、肠和皮肤病理损伤也比后者严重。WK组小鼠的aGVHD评分和肝脏、肺、肠、皮肤病理损伤介于WW组小鼠和KK组小鼠之间。受体小鼠达到供者完全嵌合。50%的KK+IL-17组小鼠生存超过18天，80%的KK+PBS组小鼠在移植后18天内死亡。KK+IL-17受体小鼠生存时间明显长于KK+PBS受体小鼠（P<0.05）。KK+PBS受体小鼠aGVHD评分高于KK+IL-17受体小鼠，并且肝脏、肺、肠、皮肤病理损伤也比后者严重。受体小鼠达到供者完全嵌合。结论：在小鼠清髓性异基因造血干细胞移植中，Th17细胞促进aGVHD，而IL-17抑制aGVHD。二、Th17细胞促进清髓性异基因造血干细胞移植aGVHD的机制目的：本研究旨在探讨清髓性异基因造血干细胞移植中Th17细胞促进aGVHD的机制。方法：采用BALB/C（H-2d）小鼠做为受体小鼠，进行全身性照射的清髓性移植前预处理（8.5Gy），移植WT C57BL/6（H-2b）小鼠1×107个TCD-BMCs和1×106个Th17细胞，或者移植WT C57BL/6（H-2b）小鼠1×107个TCD-BMCs和1×106个CD4+IL-17-/-T细胞。在骨髓移植后第12天，收取小鼠的脾脏、肝脏、肺和肠，分离得到各个组织单细胞悬液，以荧光素标记的流式抗体检测NK细胞（natural killercell，NK cell）、NKT细胞（natural killer T cell，NKT cell）、巨噬细胞（macrophages，Mφ）、树突状细胞（dendritic cell, DC）、中性粒细胞（neutrophilic，Ne）、CD4+T细胞、CD8+T细胞、IFN-γ+细胞等细胞的百分比。并且运用流式液相多重蛋白定量技术（Cytometric Bead Array CBA）测定血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达水平。应用Graphad Prism5软件对上述指标的结果进行统计学分析结果：我们发现Th17细胞受体小鼠脾脏、肝脏、肺中的Th1细胞百分比高于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠（P<0.05），两种受体小鼠肠道Th1细胞百分比没有差别（P>0.05）。Th17细胞受体小鼠肝脏和肺中的Th17细胞百分比高于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠（P<0.05）；Th17细胞受体小鼠脾脏中的Th17细胞百分比细胞显著高于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠（P<0.01）。Th17细胞受体小鼠脾脏、肝脏、肺和肠中Th2细胞百分比低于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠（P<0.05）。Th17细胞受体小鼠脾脏、肝脏和肠道的CD4+CD69+T细胞百分比高于CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠（P<0.05），在肺中更明显（P<0.01）。两组小鼠NK细胞、NKT细胞、DC、Mφ等细胞百分比无差别。和CD4+IL-17-/-T细胞受体小鼠相比，Th17细胞受体小鼠血清IL-6、IFN-γ水平升高（P<0.05），而两组受体小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α的水平没有差别。结论：在小鼠的清髓性异基因造血干细胞移植中，Th17细胞通过促进受体小鼠脾脏、肝脏和肺中Th1细胞的浸润，促进受体小鼠脾脏、肝脏和肠中T细胞活化，减少受体小鼠脾脏、肝脏、肺和肠中Th2细胞的量来加速aGVHD的进程。三、IL-17抑制清髓性异基因造血干细胞移植aGVHD的机制目的：本实验旨在探讨清髓性异基因造血干细胞移植中IL-17抑制aGVHD的机制。方法：实验分两部分。第一部分：BABL/C小鼠在移植前接受清髓性预处理（全身照射8.5Gy），然后随机分为三组，移植WT C57BL/6小鼠1×107个BMCs和5×106SCs（WW组），或移植WT C57BL/6小鼠1×107个BMCs和C57BL/6IL-17-/-小鼠5×106个SC(sIL-17-/-SCs)（WK组），或移植C57BL/6IL-17-/-小鼠1×107个BMCs(IL-17-/-BMCs)和5×106个IL-17-/-SCs（KK组）。在骨髓移植后第12天，收取小鼠的脾脏、肝脏、肺和肠，分离得到各个组织单细胞悬液。以荧光素标记的抗体检测NK cell、NKT cell、Mφ、 DCs、Ne、Th1细胞、Tc1细胞、Th17细胞、Th2细胞、CD4Treg细胞和CD8Treg细胞等细胞的百分比。同时运用CBA测定血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达水平。然后应用Graphad Prism5软件对上述指标的结果进行统计学分析。第二部分：BABL/C小鼠接受清髓性预处理（全身照射8.5Gy），移植1×107个IL-17-/-BMCs和5×106个IL-17-/-SCs。然后把小鼠随机分为两组，一组经腹腔注射200μL/只PBS（KK+PBS组），另一组经腹腔注射2μg/只（200μL体积）小鼠重组IL-17（KK+IL-17组）。在移植后第12天取两组小鼠脾脏、肝脏、肺，小肠并分离得到各个组织单细胞悬液。以荧光素标记的抗体检测NK cell、NKT cell、Mφ、 DCs、Ne、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、CD4Treg细胞和CD8Treg细胞。运用CBA技术测定血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α的表达水平，并应用GraphadPrism5软件对上述指标的结果进行统计学分析。结果：我们分析了WW细胞、WK细胞和KK细胞受体小鼠的脾脏、肝脏、肺和肠中Th1细胞的百分比。发现KK细胞受体小鼠脾脏中的Th1细胞百分比高于WK细胞受体小鼠（P<0.05），显著高于WW细胞受体小鼠（P<0.01）。KK细胞受体小鼠肝脏中的Th1细胞百分比高于WW细胞受体小鼠（P<0.05）；与WK细胞受体小鼠相比，KK细胞受体小鼠肝脏Th1细胞百分比虽然升高，但没有统计学差异（P>0.05）。KK细胞受体小鼠肠道中的Th1细胞百分比高于WK细胞和WW细胞受体小鼠（P<0.05）。我们也发现WW细胞、WK细胞和KK细胞受体小鼠肺中的Th1细胞百分比没有差别。我们还发现，KK细胞受体肠道中的Tc1细胞百分比高于WW细胞受体（P<0.05）。KK细胞受体脾脏、肝脏和肠道中的Mφ百分比高于WW细胞受体（P<0.05）；KK细胞受体脾脏、肝脏和肠道中的Mφ百分比和WK细胞受体相比没有差别；WK细胞受体脾脏、肝脏和肠道中的Mφ百分比和WW细胞受体之间没有差别。WW细胞受体、WK细胞受体和KK细胞受体肺中的Mφ百分比两两相比没有差别。CBA检测结果显示KK细胞受体血清中IFN-γ的水平高于WW细胞受体（P<0.05）；KK细胞受体和WK细胞受体血清IFN-γ的水平没有差别；WK细胞受体和WW细胞受体血清IFN-γ的水平没有差别。我们分析了KK+PBS受体和KK+IL-17受体小鼠脾脏、肝脏、肺和肠中Th1细胞的百分比。我们发现，KK+PBS受体脾脏、肝脏和肠道中Th1细胞百分比高于KK+IL-17受体（P<0.05）；在肺中，两组受体Th1细胞百分比没有差别。在脾脏和肠道中，KK+PBS受体Mφ百分比显著高于KK+IL-17受体（P<0.01）；在肝脏中KK+PBS受体Mφ百分比高于KK+IL-17受体（P<0.05）；在肺中，两受体组Mφ百分比没有差别。在脾脏中，KK+IL-17受体CD8Treg细胞百分比高于KK+PBS受体（P<0.05）。CBA检测结果显示KK+PBS受体血清中IFN-γ的水平高于KK+IL-17细胞受体（P<0.05）。结论：在清髓性异基因造血干细胞移植中，IL-17主要通过减少脾脏，肝脏和肠道中Th1细胞的数量来发挥其抑制aGVHD的作用，其机制可能是通过降低了巨噬细胞在脾脏，肝脏和肠道中的炎性侵润，减少了IFN-γ的分泌，从而影响了Th1细胞的分化。

全文目录


中文摘要  4-9
Abstract  9-15
目录  15-16
引言  16-22
  参考文献  19-22
第一部分 Th17 细胞和 IL-17 在清髓性异基因造血干细胞移植 aGVHD 中的作用  22-39
  前言  22-23
  材料和方法  23-31
  结果  31-36
  讨论  36-37
  参考文献  37-39
第二部分 Th17 细胞促进清髓性骨髓移植 aGVHD 的机制  39-65
  前言  39-40
  材料与方法  40-51
  结果  51-58
  讨论  58-60
  参考文献  60-65
第三部分 IL-17 抑制清髓性异基因骨髓移植 aGVHD 的机制  65-92
  前言  65-66
  材料与方法  66-77
  结果  77-87
  讨论  87-89
  参考文献  89-92
综述 1：Th17 细胞和 IL-17 功能研究进展  92-103
  摘要  92
  引言  92-97
  参考文献  97-103
综述 2: Th17 细胞和 IL-17 在移植物抗宿主病中的研究进展  103-111
  摘要  103-107
  参考文献  107-111
中英文缩略词汇表  111-114
攻读学位期间公开发表的论文  114-115
致谢  115-116

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 治疗学 > 血液疗法 > 骨髓移植
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