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纳米金标记—逐步银染法快速检测金黄色葡萄球菌

作　者: 刘小兰
导　师: 徐克前
学　校: 中南大学
专　业: 临床医学
关键词: HEPES 纳米金 生物素-链霉亲和素 逐步银染 金黄色葡萄球菌
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的：建立一种可以在微孔板上快速检测金黄色葡萄球菌的纳米金标记-逐步银染法,并将该方法应用于多种临床标本的快速检测。方法：采用HEPES还原法制备纳米金,并使其与巯基修饰的寡核苷酸探针偶联从而制备纳米金探针。以金黄色葡萄球菌特异的nuc基因为靶序列,利用己包被链霉亲和素的微孔板,将PCR扩增的nuc基因与生物素探针、纳米金探针形成的三明治杂交结构锚定其上,加入银染液于低温下逐步银染显色,通过酶标仪检测放大的银染信号。评价该方法的灵敏度、特异性及重复性。对51例临床标本进行检测,并将检测结果与PCR法、培养生化鉴定法进行比较。结果：制备出平均粒径为12nm,且高度分散的纳米金溶液。标记了巯基探针的纳米金的最大吸收峰发生了5nm红移。通过一系列优化实验建立微孔板上纳米金标记-逐步银染检测体系：逐步银染的条件为4℃银染,5min×4次；杂交体系中生物素探针的最适浓度为100nmol/L；纳米金探针最适浓度为20nmol/L.该方法可以在显著降低非特异性背景信号的同时放大银染信号,检测金黄色葡萄球菌nuc基因的灵敏度为1pmol/L,比常温一步银染法的灵敏度提高约102倍。与所试验的其他菌株均无非特异性扩增与杂交。600pmol/L和6nmol/L靶序列的批内、批间变异系数均小于10%。51例临床标本的检测结果与PCR法一致,与培养生化鉴定法的检测结果之间无显著性差异(P>0.05)。结论：本研究成功构建了金黄色葡萄球菌的纳米金标记-逐步银染法。该方法具有简便快速、灵敏度高、特异性强等优点,不需要特殊仪器仅在酶标仪上即可完成结果的检测,在病原微生物的快速检测领域表现出广阔的发展潜力。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
英文缩略词表  11-12
第一章 前言  12-15
第二章 材料与方法  15-26
  2.1 材料  15-18
    2.1.1 细菌  15
    2.1.2 临床标本  15
    2.1.3 仪器  15-16
    2.1.4 试剂  16
    2.1.5 试剂配制  16-18
  2.2 方法  18-26
    2.2.1 引物及探针设计  18-19
    2.2.2 基因组DNA提取及PCR扩增  19-21
      2.2.2.1 金黄色葡萄球菌基因组DNA提取  19-20
      2.2.2.2 PCR扩增及产物纯化  20-21
    2.2.3 纳米金的制备及纳米金探针的标记  21-22
      2.2.3.1 HEPES还原法制备纳米金  21
      2.2.3.2 纳米金探针标记  21-22
    2.2.4 纳米金标记-逐步银染反应体系的优化  22-23
      2.2.4.1 低温银染次数的优化  22
      2.2.4.2 生物素探针的优化  22-23
      2.2.4.3 纳米金探针的优化  23
    2.2.5 方法学评价  23-25
      2.2.5.1 两种银染方法的比较  23-24
      2.2.5.2 灵敏度  24
      2.2.5.3 线性范围  24-25
      2.2.5.4 特异性  25
      2.2.5.5 批内、批间重复性  25
    2.2.6 临床标本的检测  25
    2.2.7 统计学方法  25-26
第三章 结果  26-34
  3.1 纳米金及纳米金探针的表征结果分析  26-27
  3.2 纳米金标记-逐步银染反应体系的优化结果  27-30
    3.2.1 低温银染次数的优化结果  27-28
    3.2.2 生物素探针的优化结果  28-29
    3.2.3 纳米金探针的优化结果  29-30
  3.3 方法学评价  30-32
    3.3.1 两种银染方法检测结果的比较  30
    3.3.2 灵敏度  30
    3.3.3 线性范围  30-32
    3.3.4 特异性  32
    3.3.5 批内、批间重复性  32
  3.4 临床标本检测结果  32-34
第四章 讨论  34-40
  4.1. 纳米金比色法在核酸检测中的应用  34-35
  4.2 纳米金标记-逐步银染法  35-40
    4.2.1 纳米金标记-逐步银染法的实验原理  35-37
    4.2.2 纳米金探针的设计与标记  37
    4.2.3 纳米金标记-逐步银染体系的优化  37-38
    4.2.4 方法学评价  38
    4.2.5 临床标本的检测  38-40
第五章 结论  40-41
第六章 参考文献  41-46
综述  46-57
  参考文献  53-57
致谢  57-58
攻读硕士学位期间的研究成果  58

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中图分类: > 医药、卫生 > 临床医学 > 诊断学 > 实验室诊断 > 免疫学检验
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