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mVEGF表位疫苗在小鼠移植瘤的应用

作　者: 刘英富
导　师: 孙志贤; 王清明
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 血管内皮生长因子免疫血清疫苗载体蛋白
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肿瘤的生长离不开营养的供给，因此，肿瘤新生血管的形成对于肿瘤的生长具有重要意义。在众多血管生成有关的细胞因子中，VEGF是最重要的调节因子，很多肿瘤的生长过程都伴随着VEGF的高表达，许多研究表明，抑制VEGF的生物学活性就能抑制肿瘤的生长。目前，用VEGF抗体治疗肿瘤取得了一定的临床效果，但仍存在许多不足。临床使用的VEGF抗体为人源化抗体，虽然人源化程度较高，但仍存在异源性的问题。由于临床上用抗体治疗肿瘤需要反复多次用药，因此，抗体本身的异源性问题不容忽视。另外，抗体临床用量较大，其生产成本较高，导致抗体药物的价格较高，也一定程度上限制了其使用范围。用外源VEGF抗体治疗肿瘤是一种被动免疫治疗。如果能够采用主动免疫治疗，则可以避免VEGF抗体治疗的一些不足，如用药次数多、存在异源性等问题。但是VEGF是机体自身产生的蛋白质，有其正常的生理功能，机体对正常的自身蛋白存在免疫耐受，用自身VEGF蛋白难以诱导机体产生针对自身VEGF的抗体。本文的目的就是要设计一种mVEGF疫苗，绕开或打破机体的免疫耐受，让机体能够产生识别mVEGF的中和性抗体，以抑制肿瘤新生血管的生成，最终实现抑制肿瘤生长的目的。为了实现上述目的，我们确定了mVEGF疫苗设计的基本策略，即以mVEGF空间结构为依据，寻找mVEGF可能的抗原表位，将这些可能的抗原表位展示在一种简单的蛋白质骨架之上，形成一种新蛋白，用这种新蛋白作为可能的mVEGF疫苗。首先，我们选择了抗体重链可变区作为抗原表位展示的骨架蛋白，由于抗体的抗原结合部位是由抗体的轻链和重链可变区共同组成，单独的重链抗体可变区存在稳定性差的缺点，经过分析，我们将抗体重链可变区的部分氨基酸进行了突变，突变后的重链可变区蛋白可以很容易地实现原核表达，并可复性为稳定的蛋白质。由于抗体的重链可变区的CDR3区的是高度可变的，能够容忍不同长度序列的插入或置换，因此，CDR3区被我们选为抗原表位展示部位。根据人VEGF165的空间结构，我们分析了小鼠VEGF164的可能的抗原表位，其中表位1（EYPDEIEYIFKP）、表位2（KSHEVIKFMDV）和表位3（IMRIKPHQSQH）有可能是mVEGF的中和性抗原表位。我们用表位2的氨基酸序列替换抗体重链可变区的CDR3区氨基酸序列，形成一种新的蛋白质，命名为mFV2。将此序列转换为其基因编码序列，全基因合成其编码序列，并克隆到pET-24a表达载体上，构建了表位2表达载体。将该载体转化BL21（DE3）宿主菌，通过IPTG诱导实现了mFV2的高表达，表达的mFV2蛋白主要以包涵体形式存在，包涵体经过洗涤、纯化、裂解后，用SephacrylS-100凝胶过滤柱进行了纯化，获得了高纯度的mFV2蛋白，通过稀释法成功复性了mFV2蛋白。通过重叠PCR法将表位1和表位3编码基因成功插入到抗体可变区载体蛋白的CDR3区中，同样实现了mFV1和mFV3的表达、纯化和复性。在获得了三种小鼠表位疫苗蛋白mFV1、mFV2和mFV3后，我们首先验证了三种疫苗蛋白的免疫效果。用三种疫苗蛋白分别免疫雌性Balb/c小鼠，免疫5周后小鼠眼眶取血，获得三种免疫血清，命名为pAb1、pAb2和pAb3。ELISA检测表明，三种免疫血清的滴度均达到1：104，并且能够特异性识别VEGF164，而不与无关蛋白反应，这表明,这三种疫苗蛋白的确能够诱导机体产生特异性识别VEGF164的抗体。WesternBlot检测显示，免疫血清pAb1和pAb2能够识别VEGF164，但pFV3则不能识别VEGF164，很可能表位3是一种空间表位，在WesternBlot中该表位不能保持其空间结构。另外，通过免疫荧光实验证明，三种免疫血清都能识别B16小鼠黑色素瘤细胞中表达的VEGF164，B16细胞表达的VEGF164主要分布在胞浆中。为了验证三种免疫血清是否具有VEGF164中和活性，我们分析了三种免疫血清对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）增殖、迁移和成管能力的影响。实验结果表明，VEGF164能够促进HUVEC的增殖、迁移及成管，而pAb1、pAb2、pAb3均表现出了一定的mVEGF抑制活性，其中pAb3表现出了理想的VEGF164抑制活性。上述体外实验结果证明，三种免疫血清的确具有VEGF164中和活性，能够抑制VEGF164的生物学功能。在此基础上，我们开展了mVEGF疫苗治疗肿瘤的实验研究。首先，我们采用预防接种的方式观察三种mVEGF疫苗是否具有抑制H22实体瘤生长的作用。实验选用6-8周的雌性BALB/c小鼠，分为四组，分别是模型组、mFV1组、mFV2组和mFV3组。mFV1组、mFV2组和mFV3组分别用mFV1蛋白、mFV2蛋白和mFV3蛋白免疫三次，第5周通过ELISA检测免疫效果，并开始接种H22肿瘤细胞，待肿瘤生长到可用手摸到时开始记录肿瘤生长状态，并最终处死小鼠，分离肿瘤，称量肿瘤大小。实验结果表明，三种mVEGF疫苗均表现出了一定的抑制H22肿瘤生长的能力，其中，mFV3疫苗的效果最理想，抑瘤率达到83.8%，mFV2次之，mFV1最差。为了更直观地了解mVEGF疫苗的抑瘤机制，将H22肿瘤模型实验中各组的肿瘤组织进行了免疫组化检测，结果显示，疫苗治疗组微血管密度比模型组低，其中mFV3免疫组肿瘤的微血管密度减少最为明显，这就是为什么在三种疫苗蛋白中mFV3抑瘤作用最好的原因。同样地，利用S180肿瘤模型验证了三种mVEGF疫苗的抑瘤效果。在S180肿瘤模型上，三种疫苗的抑瘤表现与在H22肿瘤模型上的表现一致，也是mFV3疫苗的效果最理想，抑瘤率为80.3%，mFV2次之，mFV1最差。为了模拟临床上疫苗使用的实际情况，我们又开展了治疗性接种mVEGF疫苗对肿瘤生长影响及与化疗药物共用的效果观察。实验仍选用6-8周的雌性BALB/c小鼠，分为四组，分别是模型组、mFV3治疗组、顺铂治疗组和mFV3+顺铂组。实验中接种H22肿瘤细胞与给药同时进行，模型组仅注射生理盐水，顺铂组注射顺铂2mg/kg，每周一次，连续用药2次，mFV3+顺铂组为顺铂和mFV3联合治疗，小鼠接种肿瘤细胞后，注射顺铂（2mg/kg）并同时进行mFV3免疫，顺铂每周一次，连续用药2次，第14天进行mFV3第二次免疫，于第28天处死小鼠，并剥离肿瘤组织，测量肿瘤大小。实验结果为，单纯mFV3免疫组肿瘤抑制率为27.3%,单纯顺铂治疗组肿瘤抑制率为35.7%，而mFV3免疫+顺铂治疗组的肿瘤抑制率达到了66.2%。可见，mVEGF疫苗治疗和化疗之间并不冲突，二者有较好的协同效应，可联合用于肿瘤的治疗。综上所述，本文建立了一种基于抗体可变区的抗原表位展示系统，利用该系统构建了三种mVEGF疫苗，它们能够有效诱导小鼠产生VEGF164中和抗体，最终抑制小鼠实体瘤的生长。

全文目录

缩略词表  4-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
主要仪器设备及常用试剂  12-15
前言  15-19
第一部分小鼠 VEGF 表位疫苗的构建和制备  19-33
  1 材料  19-20
  2 方法  20-25
  3 结果  25-31
  4 讨论  31-33
第二部分小鼠 VEGF 表位疫苗的免疫效果分析  33-47
  1 材料  33
  2 方法  33-36
  3 结果  36-46
  4 讨论  46-47
第三部分免疫蛋白在小鼠肿瘤模型的体内验证  47-57
  1 材料  47
  2 方法  47-49
  3 结果  49-55
  4 讨论  55-57
总结  57-58
参考文献  58-62
综述  62-70
  参考文献  65-70
论著  70-78
个人简历  78-79
致谢  79

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