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ROCE与SOCE参与调节fMLP诱导的中性粒细胞极性化的研究

作　者: 唐侍豪
导　师: 邹飞
学　校: 南方医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: 钙库耗竭调节钙内流受体调节钙内流极性化中性粒细胞
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景中性粒细胞是人体免疫系统的重要组成部分,在人体循环系统中,占白细胞的50-60%。中性粒细胞聚集在损伤的组织能够引起许多免疫性疾病,而它们向着炎症刺激因子浓度高的方向发生极性化和迁移是它们聚集的必要条件。在静息条件下,中性粒细胞呈球形或椭球形,且其粘附性较差,而在炎症因子的刺激下,中性粒细胞会在刺激因子浓度高的一端形成片足,在另一端形成尾足而发生极性化,随后朝着浓度高的方向移动。许多的免疫性疾病就是由于这一过程的相关分子被不适当的激活引起的,比较常见的有过敏反应、哮喘、急性呼吸窘迫综合症、慢性阻塞性肺病,还有可能导致风湿性关节炎、动脉粥样硬化、病毒性心肌炎、炎性皮肤病甚至肿瘤的发生和肿瘤转移。另一方面,有研究证实了中性粒细胞对炎症刺激因子反应迟钝或不反应也与许多疾病相关,例如迟钝白血病综合症、髓增生异常症候症和Ⅰ型丙种球蛋白异常血症等。中性粒细胞无论是不适当激活还是反映迟钝都会导致机体出现障碍。因此,中性粒细胞的极性化和迁移是一个具有深远意义的研究,对中性粒细胞极性化机制的研究能够为中性粒细胞异常导致的组织损伤或中心粒细胞功能紊乱导致的疾病提供潜在的治疗靶点。通常情况下,趋化物通过作用于细胞膜上的G-蛋白偶联受体而将胞外信号转化为胞内应答,但不同的趋化物可能作用于不同的趋化物受体而作用于G蛋白不同的βγ亚单位从而激活不同的效应蛋白,因而不同的趋化物对细胞的极性化的现象也有比较明显的差异。中性粒细胞能够感受趋化物2%的浓度梯度变化,并由此产生极性化和迁移。目前人们常用于科学研究的中性粒细胞的趋化物有甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLP),人白三烯(LTB4),血小板激活因子(PAF),白细胞介素8(IL-8)等,其中fMLP来源于细菌的多肽,它对中性粒细胞的刺激作用最强而且效果最明显,因此,我们的课题研究选择了fMLP作为刺激中性粒细胞的趋化物。我们知道,钙离子作为第二信使,在细胞的生理病理功能中起着不可代替的作用,而且细胞内的钙动员是细胞极性化和迁移的重要原因。中性粒细胞在趋化物刺激下胞内钙离子浓度的升高是其发生极性化的必要条件,而细胞的极性化又是细胞迁移的第一步。帕尼特与他的同事们在三十年前发现,fMLP作为中性粒细胞效果最好的趋化剂,能够通过激活中性粒细胞膜上的相关受体来激活磷脂酶C (PLC),从而作用于使磷脂酰肌醇二磷酸磷酸使其分解成三磷酸肌醇(IP3)和甘油二脂,IP3与内质网上的IP3受体结合,使得内质网内的钙离子释放到细胞质内,从而导致细胞质内钙浓度升高。当内质网内的钙离子浓度降低时,内质网膜上的STIM1蛋白的EF-hand能够感受到内质网内钙离子浓度的降低,于是STIM1便向细胞膜靠近,激活细胞膜上的钙库耗竭调节钙内流通道(SOCE)引起细胞外钙离子内流。近年来,越来越多的研究都证实了通过SOCE的钙离子内流参与了细胞极性化、细胞生存、细胞迁移与转移等多种病理和生理过程。而且无论是体内实验还是体外实验,都有人提出SOCE引起的钙离子内流能够激活细胞内许多钙离子信号,从而调节细胞的极性化和迁移。在临床试验中,豪斯团队甚至证实了由于中性粒细胞功能紊乱引起的损伤和免疫性疾病与SOCE功能的增强有关。尽管目前的研究在各个方面都有了巨大的研究成果,但是仍然不清楚趋化物引起中性粒细胞的迁移是否只由SOCE机制来调节。事实上,最近有研究发现,在许多细胞中存在着一种可能与激活蛋白激酶C通道有关的非SOCE机制引起的钙内流通道,叫做受体调节钙内流通道(ROCE)。前面提到,G蛋白偶联受体是将胞外趋化物刺激转化为胞内信号的关键环节,fMLP激活G蛋白偶联受体后,其作用的下游底物都可能参与到中性粒细胞的极性和趋化性的过程中去。目前,中性粒细胞的研究主要集中在Rho, Rac和Cdc42这三个蛋白上,研究表明,用fMLP刺激人中性粒细胞能短暂的激活这三个蛋白。许多研究证明了Rho的激活对于fMLP诱导的中性粒细胞趋化性是必须的。其中,Rac2是中性粒细胞所特有的,它在中性粒细胞极性化时定位与细胞前端的片足,而Cdc42主要定位与细胞后端的尾足,并且Cdc42在调节细胞的定向迁移的起着关键作用。但是尽管小G蛋白家族成员在细胞的极性化与趋化过程的重要作用已经被证实了,但是这个具体机制仍然不清楚且受到广泛的争议,而且不同的钙信号与小G蛋白家族相互作用引起的细胞极性化的机制是否不同也有待研究。SOCE与ROCE是否通过激活小G蛋白家族来实现其功能的研究更是少之又少。目的我们假设在中性粒细胞上,fMLP刺激中性粒细胞不但可以诱发SOCE,而且同时诱发ROCE。我们的研究中不但使用了药理性抑制剂如PKC通道抑制剂calphostin C以及PLC通道抑制剂U73122,还使用了抗体封闭技术处理之后观察fMLP诱导的细胞外钙离子内流的情况。同时,我们抑制SOCE与ROCE之后观察了fMLP诱导的中性粒细胞极性化的改变,探讨SOCE与ROCE在中性粒细胞极性化过程中的作用。最后,我们观察了SOCE或ROCE抑制剂对fMLP激活Rac2和Cdc42的抑制情况,确认这两种蛋白是否参与到SOCE与ROCE调节的中性粒细胞极性化过程。方法：1.从成年男性健康自愿者的外周血中获取人中性粒细胞。用6%的葡聚糖沉降法去除大部分的红细胞,剩余的少量红细胞使用双蒸水裂解后离心去除。使用淋巴细胞分离液梯度离心去除淋巴细胞。整个过程都在4℃下操作。提取到的中性粒细胞用D-Hanks液重悬,调节细胞浓度为1.0×106。2.使用钙离子敏感性指示剂Fluo-4/AM预处理细胞后,在激光共聚焦显微镜下监测细胞内钙离子的变化情况。具体操作如下：细胞经相关处理后用Hanks’缓冲液重悬,然后加入5μM Fluo-4/AM在37℃避光孵育30分钟。无钙缓冲液用CaCl2加入0.3mM EGTA配制而成。实验之前,中性粒细胞在无钙缓冲液中静置30分钟,待贴壁后进行后续实验。Fluo-4的激发波长为488nm。3.细胞悬液加入到电转杯后加入2.5μg/ml的STIM1抗体进行电穿孔,电转效率使用免疫沉淀和蛋白免疫印迹的方法检测。4.采用Zigmond chamber迁移小室进行中性粒细胞极性化实验的检测。中心粒细胞按1×106重悬于HBSS缓冲液。取20μ1细胞悬浮液滴于盖玻片上,室下静置5min后倒扣于Zigmond迁移小室上,在两小室的一边加入HBSS缓冲液,另一边加入含100nM fMLP的HBSS缓冲液,在倒置显微镜×20下观察细胞的极性化和迁移情况并进行拍照,每组均采用fMLP刺激30分钟的细胞图片进行细胞定向极化率统计。定向迁移形成尾足且迁移方向的长宽比例大于2：1的细胞被定义为定向极性化细胞[1]。PKC抑制剂calphostin C, PLC抑制剂U73122以及GdCl3预处理细胞20分钟后检测极性化的变化。5.利用GST pull-down技术分析PKC抑制剂calphostin C, PLC抑制剂U73122以及GdCl3对fMLP激活Rac2和Cdc42的抑制作用。分离的中性粒细胞用三种抑制剂分别处理20分钟后加入100nM的fMLP刺激5分钟,然后加入5ml PBS终止反应,离心弃上清后加入细胞裂解液,4℃,12,000rpm离心15分钟,取5%的总蛋白作为内参,剩下的蛋白加入20μg PAK-GST蛋白珠子4℃孵育1小时,清洗离心后加入蛋白上样缓冲液100℃煮5分钟,之后使用相应抗体用Western blot检测激活情况。6.实验数据用均数±标准差(x±SD)表示,数据经SPSS13.0软件处理分析。两组之间样本均数比较用两独立样本T检验,三组及三组以上样本均数比较满足方差齐性用One-way ANOVA方差分析,组间两两比较采用LSD法；若方差不齐,采用welch检验,组间两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为存在显著性差异。结果1.2μM的GdCl3对fMLP诱导的内质网内钙离子释放没有影响,但是能够抑制大约85%的细胞外钙离子的内流(T=9.168,P=0.000)。2. STIM1抗体封闭效果明显,且对fMLP诱导的内质网内钙离子释放几乎没有抑制作用,但是能够抑制细胞外钙离子的内流(F=8.430,P=0.009)。3. fMLP诱导的Sr2+内流大约是Ca2+内流的20%左右(F=50.320,P=0.000)。4.PLC抑制剂U73122能够几乎完全抑制fMLP诱导的中性粒细胞极性化(T=44.274,P=0.000)。5.不加Gd3+的情况下,fMLP诱导的中性粒细胞大约有80%发生极性化,而经过Gd3+处理之后,仅剩下约5%的细胞发生极性化(T=21.166,P=0.000)。6.利用抗体封闭技术封闭STIM1后fMLP诱导的中性粒细胞极性化率剩下6%左右(F=421.560,P=0.000)。7.PKC抑制剂calphostin C对fMLP诱导的内质网钙释放没有影响,但是几乎完全抑制了Sr2+内流(T=2.827,P=0.012)。8.PKC抑制剂calphostin C能够抑制中性粒细胞极性化,与对照组相比,细胞极性化率从80%降低至13%(T=14.056,P=0.000)。9. fMLP诱导的中性粒细胞的Rac2和Cdc42的激活能够被Gd3+和PKC抑制剂calphostin C抑制,而PLC抑制剂U73122并不能进一步抑制Rac2和Cdc42的激活。结论fMLP诱导的中性粒细胞极性化过程中,外钙内流包含SOCE和ROCE两种途径,并且这两条途径与激活小G蛋白Rac2和Cdc42有关。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-18
前言  18-31
材料与方法  31-41
  1、实验材料  31-35
  2、实验方法  35-41
结果  41-59
  1、fMLP诱导的外钙内流由SOCE与ROCE共同调节  41-48
  2、SOCE参与了fMLP诱导的中性粒细胞极性化  48-53
  3、ROCE参与了fMLP诱导的中性粒细胞极性化  53-57
  4、fMLP能够通过激发SOCE与ROCE来调节Rac2和Cdc42的激活  57-59
讨论  59-63
全文小结  63-64
参考文献  64-68
硕士期间主要成果  68-69
致谢  69-70

ROCE与SOCE参与调节fMLP诱导的中性粒细胞极性化的研究

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