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小分子与蛋白相互作用分析的生物传感方法研究

作 者: 林健
导 师: 蒋健晖
学 校: 湖南大学
专 业: 分析化学
关键词: 光学生物传感器 DNA裂解 小分子 蛋白质 相互作用
分类号: R34
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


蛋白质的相关信息一直是生命科学研究的重点,其中小分子与蛋白质的相互作用近年来引起了人们的研究兴趣。蛋白质的许多重要功能都有小分子的参与,研究小分子与蛋白质相互作用对促进生命科学的发展有着重要意义。利用化学小分子的多样性,选择适当的活性小分子,设计合成能够高选择性地探测蛋白质的功能、结构以及与活性小分子作用模式的探针——化学小分子探针,可以为重大疾病的诊断和防治提供新的标记物、新的药物作用靶点和新的先导结构,从而为创新药物的发现奠定基础。随着对生命科学的深入研究,发展能测定宽范围亲和力的小分子-蛋白质方法成为生物化学、药物开发及生物传感工作者面临的迫切任务。本研究论文针对当前测量小分子-蛋白质相互作用方法中的一些重点、难点问题展开讨论,其主要内容如下:(1)研制了一种基于蛋白结合调控的灵敏度高、特异性强、通用度好的DNA裂解分子机器,用于小分子与蛋白相互作用的分析。为此,我们设计了一条标记小分子的DNA单链,与另一条长度稍长的DNA单链杂交成异源双链,再与Fok I组装形成分子机器。如果输入一条5′端标记荧光基团(FAM)和猝灭基团四甲基罗丹明(TAMRA)的荧光探针,荧光探针会与异源双链的长链互补,Fok I开始工作即切割探针,荧光基团与淬灭基团分离,荧光信号急剧增强;切割后的探针从长链上脱落,成为原来的分子机器,继续参与下一个反应。若小分子的结合蛋白存在,在荧光探针与长链互补之后,由于空间位阻作用,Fok I不能到达切割位点,荧光探针不会切开,荧光基团与淬灭基团的FRET作用依然存在,不会出现荧光信号,从而达到对目标蛋白的检测。通过分子机器与荧光探针的配对、剪开、脱离、再配对这个循环,实现了对目标蛋白的循环放大检测。在考察了叶酸-叶酸结合蛋白、叶酸-二氢叶酸还原酶、生物素-链霉亲和素、生物素-生物素抗体等不同亲和力的小分子-蛋白结合体系后,发现该方法特异性灵敏度高、特异性好、重现性强,有望成为一个通用的检测小分子与蛋白质相互作用的平台。(第2章)(2)将切刻酶放大技术与血红素核酸适体化学发光相结合,建立了一种基于切刻酶放大技术结合血红素适配体化学发光检测小分子-蛋白相互作用的均相分析方法。设计了一条包含切刻酶Nt.BstNBI酶切位点、血红素适配体的互补序列、分子内折叠区域三个部分的序列,当Bst DNA聚合酶大片段和dNTPs存在的条件时该序列不断被延伸、复制,切刻酶切割下游位点碱基,通过链置换反应,将血红素适配体置换掉,从而可以完成血红素适配体的循环复制。血红素-血红素适配体复合物与鲁米诺-过氧化氢体系共存时,可发出强烈的化学发光信号。当有小分子结合蛋白存在时,由于小分子与其蛋白相互作用,使聚合酶和切刻酶的活性同时受到抑制,化学发光信号减弱,从而实现了对小分子结合蛋白的检测。该方法具有灵敏度高,选择性强,重现性好等优点,有望用于高通量蛋白-小分子相互作用的筛选和检测。(第3章)

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
第1章 绪论  11-24
  1.1 生物传感器概述  11-12
    1.1.1 生物传感器的原理与结构  11-12
    1.1.2 生物传感器的分类  12
  1.2 亲和型生物传感器  12-17
    1.2.1 亲和力识别元件  13-14
    1.2.2 识别元件的固定  14-16
    1.2.3 信号转换器的种类  16-17
  1.3 光学生物传感器  17-22
    1.3.1 无源光学生物传感器  17-19
    1.3.2 光致光学生物传感器  19-22
  1.4 本研究工作的构思  22-24
第2章 基于DNA 裂解分子机器的生物传感技术检测小分子与蛋白相互作用  24-46
  2.1 前言  24-25
  2.2 实验部分  25-28
    2.2.1 试剂与仪器  25-26
    2.2.2 叶酸标记氨基修饰的核酸  26
    2.2.3 DNA 裂解分子机器的构建  26-27
    2.2.4 分子机器检测小分子与蛋白相互作用  27
    2.2.5 DNA 裂解分子机器的荧光响应  27
    2.2.6 毛细管电泳  27-28
  2.3 结果与讨论  28-45
    2.3.1 DNA 裂解分子机器的设计与构建  28-29
    2.3.2 DNA 裂解分子机器的响应特性  29-34
    2.3.3 毛细管电泳表征  34-35
    2.3.4 小分子标记的位点优化  35-36
    2.3.5 DNA 异源双链结构优化  36-38
    2.3.6 分子机器的工作曲线  38-42
    2.3.7 蛋白的小分子竞争物  42-43
    2.3.8 干扰实验  43-45
  2.4 小结  45-46
第3章 基于切刻酶放大的生物传感技术检测小分子与蛋白相互作用  46-57
  3.1 前言  46-47
  3.2 实验部分  47-49
    3.2.1 试剂与仪器  47
    3.2.2 叶酸标记氨基修饰的核酸  47
    3.2.3 DNA 分子机器的构建  47-48
    3.2.4 DNA 分子机器检测小分子蛋白相互作用  48
    3.2.5 化学发光检测DNA 分子机器的循环  48
    3.2.6 电泳实验  48-49
  3.3 结果与讨论  49-55
    3.3.1 DNA 分子机器的设计与构建  49
    3.3.2 DNA 分子机器的响应特性  49-51
    3.3.3 DNA 分子机器的性质  51-52
    3.3.4 DNA 分子机器工作原理表征  52-53
    3.3.5 DNA 分子机器工作曲线  53-55
    3.3.6 干扰实验  55
  3.4 小结  55-57
结论  57-58
参考文献  58-68
致谢  68

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体生物化学、分子生物学
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