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基于嗅觉受体的仿生分子及细胞传感器的研究

作　者: 杜立萍
导　师: 王平; 刘清君
学　校: 浙江大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 仿生嗅觉传感器嗅觉受体蛋白嗅觉受体细胞细胞网络石英晶体微天平适配体光寻址电位型传感器 DNA编码微电极阵列
分类号: R314
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

嗅觉对于生物的生存具有极其重要的意义。经过长期的自然进化,生物嗅觉系统具备了人工检测装置所无法比拟的灵敏度和特异性,成为性能最为卓越的化学传感系统,能够从复杂的环境中分辨和识别成百上千种只有痕量水平的各种气体分子。仿生嗅觉传感器从模拟生物嗅觉系统的角度出发,以嗅觉受体、细胞、组织等生物材料为敏感元件,结合二级传感器实现对气味物质的特异灵敏检测,以期获得类似生物嗅觉系统的检测性能。仿生嗅觉传感器不仅在环境监测、食品安全、农业等多个领域具有广阔的应用前景,而且能为生物嗅觉的基础研究提供了全新的研究平台,具有重要的研究意义和实际应用价值。本论文在对仿生嗅觉传感器的研究现状进行系统评述分析后,以生物嗅觉系统感知机理为研究的理论基础,结合特定类型的二级传感器及系统,分别从分子、细胞和细胞网络三个层面对仿生嗅觉传感器进行了系统深入的研究,开发出基于嗅觉受体的仿生嗅觉分子传感器、基于嗅觉受体细胞的仿生嗅觉细胞传感器,并对细胞网络传感器进行了初步的探讨。本论文的主要内容和创新点在于1.基于分子克隆技术,成功制备了功能性的嗅觉受体蛋白构建了嗅觉受体蛋白ODR-10的真核表达载体,并将其成功表达在异源细胞系统HEK-293细胞质膜表面。利用RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光、胞内钙离子浓度分析等技术对嗅觉受体蛋白ODR-10的表达、亚细胞定位以及功能进行鉴定。结果表明,异源表达的嗅觉受体蛋白ODR-10具有特异性识别其天然配体丁二酮的功能,适合用于开发仿生嗅觉传感器。2.研制了基于嗅觉受体蛋白的仿生嗅觉受体分子传感器以嗅觉受体蛋白ODR-10为敏感元件,结合石英晶体微天平作为二级传感器,研制了一种仿生嗅觉受体分子传感器,实现了对气味物质丁二酮的特异灵敏检测。为将嗅觉受体蛋白ODR-10与石英晶体微天平有效耦合,提出一种基于适配体的嗅觉受体蛋白特异性固定方法,在石英晶体微天平表面同时实现了嗅觉受体蛋白的固定与纯化,提高了敏感元件与传感器的耦合效率。结果表明该方法大大改善了仿生嗅觉分子传感器的性能,使该传感器的检测下限达到1.5ppm。3.基于基因工程化嗅觉受体细胞,研制了一种仿生嗅觉受体细胞传感器基于基因工程的原理,成功制备了一种特异表达嗅觉受体蛋白ODR-10的嗅觉受体细胞。由于该嗅觉受体细胞表面不但具有类型明确的嗅觉受体ODR-10,而且具有内在的电兴奋性,在气味物质刺激后可引发嗅觉受体细胞的动作电位发放。利用该细胞作为气味检测的敏感元件,结合光寻址电位型传感器(light addressable potentiometric sensor, LAPS)独特的光寻址检测能力,成功检测到嗅觉受体细胞在不同气味物质刺激下的电活动。结果表明仿生嗅觉受体细胞传感器对嗅觉受体蛋白ODR-10的天然配体丁二酮具有独特的响应模式,对嗅觉受体细胞的胞外电信号进行时域和频域特征分析后,可以有效地分辨出不同浓度的丁二酮信息。4.提出了两种体外制备细胞网络的方法嗅觉细胞网络内在的信号处理及信息编码能力是生物嗅觉系统强大的气味识别功能的重要基础,以细胞网络为敏感材料有望大幅提高仿生嗅觉传感器的性能。为解决细胞网络与传感器检测平台有效耦合这一关键问题,我们提出两种体外培养生长模式可控的细胞网络的技术,实现细胞在微电极阵列(microelectrode array, MEA)芯片上的特异性固定与生长。在微电极阵列芯片加工时改变电极位点的排布模式可方便地改变细胞网络的生长模式,为实现体外制备生长模式可控的嗅觉细胞网络奠定了基础。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章绪论  14-40
  1.1 仿生嗅觉受体传感器的研究进展  14-24
    1.1.1 功能性嗅觉受体蛋白的制备  15-18
    1.1.2 嗅觉受体蛋白在传感器表面的固定  18-20
    1.1.3 仿生嗅觉受体传感器研究概况  20-24
  1.2 仿生嗅觉受体细胞传感器的研究进展  24-28
    1.2.1 功能性嗅觉受体细胞的制备  24-26
    1.2.2 仿生嗅觉受体细胞传感器研究概况  26-28
  1.3 仿生嗅觉细胞网络传感器的研究进展  28-32
    1.3.1 功能性嗅觉细胞网络的制备  28-30
    1.3.2 仿生嗅觉细胞网络传感器的研究概况  30-32
  1.4 论文的主要研究内容  32-33
  1.5 参考文献  33-40
第二章嗅觉的生物学基础  40-54
  2.1 哺乳类生物嗅觉系统的组织结构  40-42
  2.2 嗅觉感受的分子生物学基础  42-48
    2.2.1 嗅觉感受神经元及其表达的各类受体  42-45
    2.2.2 犁鼻感受神经元及其表达的各类受体  45-46
    2.2.3 气味结合蛋白  46-48
  2.3 嗅觉感受的细胞内信号转导机制  48-51
    2.3.1 cAMP介导的嗅觉感受神经元胞内信号转导  48-49
    2.3.2 cGMP介导的嗅觉感受神经元胞内信号转导  49-50
    2.3.3 IP_3介导的细胞内信号转导  50-51
  2.4 嗅觉细胞网络对信号的编码与解码  51-52
  2.5 本章小结  52-53
  2.6 参考文献  53-54
第三章异源表达线虫嗅觉受体蛋白ODR-10  54-70
  3.1 线虫嗅觉系统的组织结构及功能  54-55
  3.2 线虫嗅觉受体ODR-10简介  55-57
    3.2.1 嗅觉受体ODR-10的基因及蛋白结构  55-56
    3.2.2 嗅觉受体ODR-10的天然配体  56-57
  3.3 嗅觉受体在人胚胎肾细胞(HEK-293)的表达  57-62
    3.3.1 构建真核表达载体  57-58
    3.3.2 HEK-293细胞的培养及转染  58-59
    3.3.3 RT-PCR和Western Blot鉴定  59-61
    3.3.4 细胞免疫荧光及钙离子成像鉴定  61-62
  3.4 嗅觉受体蛋白ODR-10表达结果及功能鉴定  62-68
    3.4.1 表达载体双酶切鉴定结果  62-63
    3.4.2 RT-PCR和Western Blot结果  63-64
    3.4.3 细胞免疫荧光结果  64-65
    3.4.4 钙离子成像鉴定受体功能结果  65-68
  3.5 本章小结  68-69
  3.6 参考文献  69-70
第四章基于石英晶体微天平的仿生嗅觉受体分子传感器研究  70-96
  4.1 石英晶体微天平传感器的工作原理  70-74
    4.1.1 压电效应及压电石英晶体  70-73
    4.1.2 石英晶体微天平传感器检测系统  73-74
  4.2 嗅觉受体蛋白ODR-10的提取制备  74-75
  4.3 基于适配体的嗅觉受体蛋白固定方法  75-84
    4.3.1 适配体简介  76-77
    4.3.2 基于适配体的嗅觉受体蛋白固定过程  77-79
    4.3.3 电化学表征嗅觉受体蛋白的固定  79-83
    4.3.4 原子力显微镜表征嗅觉受体蛋白的固定  83-84
  4.4 仿生嗅觉受体分子传感器对气味分子的检测  84-91
    4.4.1 仿生嗅觉受体分子传感器及其检测系统  84-85
    4.4.2 仿生嗅觉受体分子传感器的性能  85-90
    4.4.3 研究结果讨论  90-91
  4.5 本章小结  91
  4.6 参考文献  91-96
第五章基于基因工程技术的仿生嗅觉受体细胞传感器研究  96-118
  5.1. 引言  96-97
  5.2. LAPS传感器的原理及检测系统  97-102
    5.2.1 LAPS芯片及检测原理  97-99
    5.2.2 LAPS芯片的加工及封装  99-100
    5.2.3 LPAS细胞传感器电生理检测系统  100-102
  5.3. 制备特异性表达ODR-10的嗅觉受体细胞  102-104
    5.3.1 构建表达载体pEGFP-N1/rho-tag/odr-10  102-103
    5.3.2 基因工程技术制备表达ODR-10的嗅觉受体细胞  103-104
  5.4. 嗅觉受体细胞与LAPS芯片的耦合  104-106
  5.5. 仿生嗅觉受体细胞传感器对气味分子的检测  106-114
    5.5.1 仿生嗅觉受体传感器对气味物质的检测  106-107
    5.5.2 嗅觉受体细胞电信号的频域特征  107-109
    5.5.3 仿生嗅觉受体细胞传感器时域响应特征  109-114
  5.6. 本章小结  114-115
  5.7. 参考文献  115-118
第六章细胞网络在微电极阵列芯片上的特异性固定生长研究  118-140
  6.1 引言  118-119
  6.2 微电极阵列(MEA)芯片及检测系统  119-128
    6.2.1 微电极阵列(MEA)芯片的加工制备  119-122
    6.2.2 微电极阵列(MEA)芯片的检测系统  122-123
    6.2.3 微电极阵列(MEA)芯片表面修饰及性能评估  123-128
  6.3 DNA编码的细胞网络在芯片上生长  128-134
    6.3.1 DNA编码细胞在MEA上特异性生长原理  129-132
    6.3.2 细胞表面共价连接单链DNA探针结果  132
    6.3.3 DNA编码细胞在MEA芯片特异性固定结果  132-134
  6.4 利用己二硫醇在MEA芯片上研制细胞网络  134-136
    6.4.1 己二硫醇介导细胞在MEA表面特异性固定原理  134-135
    6.4.2 己二硫醇介导细胞在MEA表面固定结果  135-136
  6.5 本章小结  136-137
  6.6 参考文献  137-140
第七章总结与展望  140-148
  7.1 全文总结  140-144
  7.2 工作展望  144-146
  7.3 参考文献  146-148
作者简历  148
攻读学位期间发表的学术论文及成果  148-152
致谢  152

基于嗅觉受体的仿生分子及细胞传感器的研究

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