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白藜芦醇对脂多糖诱导的肺泡巨噬细胞微小RNA-146a表达的影响

作 者: 邵强
导 师: 钱克俭
学 校: 南昌大学
专 业: 急诊医学
关键词: 白藜芦醇 微小RNA-146a 肺泡巨噬细胞 肿瘤坏死因子-α
分类号: R285.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


目的:观察白藜芦醇对脂多糖(LPS)诱导肺泡巨噬细胞微小RNA-146a(miR-146a)表达的影响,探讨白藜芦醇对肺泡巨噬细胞炎症反应的调控作用及其机制,为临床治疗脓毒症肺损伤提供新的治疗途径。方法:将体外培养的大鼠肺泡巨噬细胞(NR8383)按2×106个/孔接种于六孔板,细胞贴壁90min,分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、终浓度1μg/ml LPS处理组、1μg/ml白藜芦醇预处理30min+终浓度1μg/ml LPS处理组、10μg/ml白藜芦醇预处理30min+终浓度1μg/ml LPS处理组,细胞培养6h后,观察各组细胞形态学改变,并收集细胞和细胞培养上清液,采用实时荧光定量PCR检测细胞中TNF-αmRNA和miR-146a的表达变化,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清液中TNF-α蛋白的表达变化。结果:1. LPS刺激NR8383细胞6h后,细胞生长缓慢、贴壁能力减弱、部分细胞死亡,白藜芦醇预处理细胞后,能减轻LPS对细胞的损伤作用、维持细胞的贴壁、促进细胞生长,并且对细胞的保护作用呈药物剂量依赖性;2. LPS刺激NR8383细胞6h后,相对于PBS对照组,LPS处理组细胞中TNF-α mRNA的表达量升高了50.05±8.08倍(P<0.01),培养上清液中TNF-α蛋白从26.15±13.43pg/ml上升到644.2±36.82pg/ml(P<0.01)、白藜芦醇预处理组(1μg/ml和10μg/ml)细胞中TNF-α mRNA的表达量分别升高了29.64±8.39倍(P<0.01)和13.54±4.50倍(P<0.01),培养上清液中TNF-α蛋白分别上升到447.7±41.48pg/ml(P<0.01)和345.0±42.54pg/ml(P<0.01);3. LPS刺激NR8383细胞6h后,相对于PBS对照组,LPS处理组细胞中miR-146a的表达升高了5.92±1.57(P<0.01),白藜芦醇预处理组(1μg/ml和10μg/ml)细胞中miR-146a的表达分别升高了8.67±1.18倍(P<0.01)和11.17±1.40倍(P<0.01);结论:白藜芦醇预处理NR8383细胞后,能减轻LPS对细胞的损伤作用,抑制细胞释放炎症因子TNF-α,并上调细胞中miR-146a的表达。因此,我们推测在肺泡巨噬细胞炎症反应中,白藜芦醇可能通过上调miR-146a的表达,来负性调控TLRs/NF-κB炎症通路的活化,抑制炎症因子的产生。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第1章 引言  10-13
  1.1 肺泡巨噬细胞的过度活化是脓毒症肺损伤发生发展的关键因素  10-11
  1.2 白藜芦醇有望成为治疗脓毒症肺损伤的新药物  11
  1.3 白藜芦醇通过机体内源性调控通路 microRNA 来发挥抗炎作用  11-13
第2章 材料与方法  13-26
  2.1 实验材料  13-14
    2.1.1 细胞株  13
    2.1.2 主要试剂  13-14
    2.1.3 主要仪器与设备  14
  2.2 主要实验器材、试剂和溶液的准备  14-16
    2.2.1 细胞培养用品的处理  14-15
    2.2.2 去 RNA 酶处理  15
    2.2.3 Ham’s F-12K 培养基的配制  15
    2.2.4 LPS 溶液的配制  15-16
    2.2.5 白藜芦醇药物溶液的配制  16
    2.2.6 MTT 相关溶液的配制  16
  2.3 实验方法  16-26
    2.3.1 NR8383 细胞的培养、传代、冻存和复苏  16-17
    2.3.2 MTT 比色法检测白藜芦醇对细胞活性的影响  17-18
    2.3.3 细胞处理及分组  18
    2.3.4 细胞总 RNA 提取、定量和质量检测  18-19
    2.3.5 SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 检测 TNF-α mRNA 的表达  19-21
    2.3.6 TaqMan 实时荧光定量 PCR 检测 miR-146a 的表达  21-23
    2.3.7 ELISA 检测上清中 TNF-α蛋白的表达  23-25
    2.3.8 统计学处理  25-26
第3章 结果  26-33
  3.1 MTT 比色法检测白藜芦醇对 NR8383 细胞活性的影响  26-27
  3.2 各实验组细胞形态学改变  27-28
  3.3 细胞总 RNA 质量和浓度测定  28
  3.4 PCR 扩增的特异性  28-30
  3.5 各实验组 NR8383 细胞 TNF-α mRNA 的表达  30
  3.6 各实验组 NR8383 细胞 miR-146a 的表达  30-31
  3.7 大鼠 TNF-α蛋白标准曲线图  31-32
  3.8 各实验组 NR8383 细胞 TNF-α蛋白的表达  32-33
第4章 讨论  33-36
第5章 结论与展望  36-37
  5.1 结论  36
  5.2 进一步工作的方向  36-37
致谢  37-38
参考文献  38-42
攻读学位期间的研究成果  42-43
综述  43-48
  参考文献  45-48

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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