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补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP-15及其Smads信号通路影响的研究

作　者: 白静
导　师: 杜惠兰
学　校: 河北医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 补肾调经方逍遥丸 BMP-15 BMPRII ALK6 Smad1 Smad5 Smad8
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：本课题组前期实验结果已证实，补肾调经方、逍遥丸均可提高IVF-ET控制性促排卵患者的临床妊娠率，并增加卵泡液中BMP-15的蛋白含量和颗粒细胞中BMP-15mRNA的表达，提示补肾调经方、逍遥丸促进卵泡发育、改善卵子质量的作用可能与其调控卵母细胞分泌因子BMP-15的分泌有关。BMP-15与细胞膜上BMPRⅡ和ALK6结合激活Smad1/5/8进行信号转导，BMP-15及其Smads信号通路对卵泡发生发育、卵丘扩散、卵母细胞的成熟起着重要作用。本研究将补肾调经方、逍遥丸作为补肾法、疏肝法的代表方剂。在前期研究基础上，通过动物实验进一步探讨补肾法、疏肝法提高小鼠卵母细胞质量与调控BMP-15及其Smads信号通路的关系，比较两法的作用机制和环节有何异同。为中医药作为IVF-ET控制性促排卵的辅助用药提供实验依据。方法：选用6-7周龄健康雌性昆明小鼠900只，分6批进行实验，每批150只，随机分为6组：疏肝低剂量组、疏肝高剂量组、补肾低剂量组、补肾高剂量组、空白对照组和COH组，每组25只（6批每组合计150只）。实验用逍遥丸为河南宛西制药股份有限公司生产，将200、100丸逍遥丸溶于125ml蒸馏水中制成混悬液，高剂量含生药0.6g/ml，低剂量含生药0.3g/ml；补肾调经方所需药材一次性购自石家庄市乐仁堂药店，并由本校中药系制成口服液，高剂量含生药5.4g/ml，低剂量含生药2.7g/ml，置4℃冰箱中备用（高、低剂量相当于临床用量的20、10倍）。疏肝低、高剂量组（逍遥丸配合PMSG）、补肾低、高剂量组（补肾调经方配合PMSG）和COH组（PMSG），分别用逍遥丸、补肾调经方和蒸馏水灌胃，1ml/100g体重，连续10天。各治疗组及COH组于第11日同时腹腔注射PMSG10IU/只，48h后腹腔注射HCG10IU/只。空白对照组每日阴道涂片，观察动情周期。第一批小鼠于注射HCG16h后，疏肝低、高剂量组、补肾低、高剂量组和COH组各取15只小鼠；空白对照组于阴道涂片见大量角化上皮细胞次日，取15只小鼠，均脱颈椎处死，取出双侧输卵管，置于灭菌培养皿中。在体视镜下用1ml注射器针头划破输卵管壶腹部，收集卵丘卵母细胞复合体（COCs），迅速检查并记录排卵数和优质卵泡数。然后用0.05%的透明质酸酶消化掉卵丘颗粒细胞，再用PBS反复冲洗，以获得MⅡ期卵母细胞。迅速将其置于冰上，用于实时荧光定量PCR。各组剩余10只小鼠的MⅡ期卵母细胞获取方法同上，将其置于-80℃保存备用（用于Western blot）。第二批小鼠于注射HCG同时，将疏肝低、高剂量组、补肾低、高剂量组和COH组各取20只小鼠；空白对照组于阴道涂片见到大量角化上皮细胞时，取20只小鼠，与8-9周龄雄性昆明小鼠按1:1比例合笼，观察各组的妊娠率。各组剩余5只小鼠的MⅡ期卵母细胞获取方法同上，将其放入4%的多聚甲醛中固定（用于免疫组化）。第三批至第六批小鼠的MⅡ期卵母细胞获取方法同上，将一部分放入4%的多聚甲醛中固定（用于免疫组化），另一部分置于-80℃保存备用（用于Western blot）。采用Western blot、免疫组化法检测卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8蛋白的表达；采用实时荧光定量PCR检测上述指标mRNA的表达。结果：1疏肝低、高剂量组和补肾低、高剂量组小鼠排卵数、优质卵泡数及妊娠率的比较排卵数的比较：与空白对照组比较，COH组、疏肝低、高剂量组和补肾低、高剂量组的排卵数增高，有统计学意义（均P＜0.05）。与COH组比较，疏肝低、高剂量组和补肾低、高剂量组的排卵数无统计学差异（均P＞0.05）。各治疗组间获卵数比较无统计学差异（均P＞0.05）。优质卵泡率及妊娠率的比较：与空白对照组比较，COH组的优质卵泡率及妊娠率降低（均P＜0.05），疏肝高剂量组和补肾高剂量组的优质卵泡率及妊娠率增高（均P＜0.05），疏肝低剂量组和补肾低剂量组的优质卵泡率及妊娠率与其无统计学差异（均P＞0.05）。与COH组比较，疏肝低、高剂量组和补肾低、高剂量组的优质卵泡率及妊娠率均增高（均P＜0.05）。疏肝低剂量组和补肾低剂量组的优质卵泡率及妊娠率无统计学差异（均P＞0.05）。疏肝高剂量组和补肾高剂量组的优质卵泡率及妊娠率无统计学差异（均P＞0.05）。疏肝低剂量组、补肾低剂量组的优质卵泡率及妊娠率均低于疏肝高剂量组、补肾高剂量组（均P＜0.05）。2疏肝低、高剂量组小鼠卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达与空白对照组比较，COH组卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）。与空白对照组、COH组比较，疏肝低、高剂量组卵母细胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表达升高（均P＜0.05），但其在疏肝低、高剂量组间的表达无统计学差异（均P＞0.05）；疏肝低剂量组卵母细胞中BMPRII mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05），疏肝高剂量组卵母细胞中BMPRII mRNA及其蛋白的表达增高（均P＜0.05）；疏肝低、高剂量组卵母细胞中ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达增强（均P＜0.05），且疏肝低剂量组卵母细胞中ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白表达的表达均低于高剂量组（均P＜0.05）。3补肾低、高剂量组小鼠卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达与空白对照组比较，COH组卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）。与空白对照组、COH组比较，补肾低、高剂量组卵母细胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达升高（均P＜0.05），且补肾低剂量组BMP-15、ALK6、Smad1、 Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达均低于高剂量组（均P＜0.05）。与空白对照组、COH组比较，补肾低、高剂量组卵母细胞中BMPRII mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）。4疏肝组、补肾组小鼠卵母细胞中BMP-15、BMPRII、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白表达比较与疏肝低剂量组比较，补肾低、高剂量组卵母细胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达均升高（均P＜0.05），BMPRII mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）。与疏肝高剂量组比较，补肾低剂量组卵母细胞中BMP-15、ALK6、Smad1mRNA及其蛋白的表达均升高（均P＜0.05），BMPRII、Smad5、Smad8mRNA及其蛋白的表达均降低（均P＜0.05）；补肾高剂量组卵母细胞中BMP-15、ALK6、Smad1、Smad5mRNA及其蛋白的表达均升高（均P＜0.05），BMPRII mRNA及其蛋白的表达降低（均P＜0.05），Smad8mRNA及其蛋白的表达无统计学差异（均P＞0.05）。结论：1逍遥丸和补肾调经方在不减少控制性超排卵小鼠排卵数的同时，可增加控制性超排卵小鼠的优质卵泡率和妊娠率。2逍遥丸可通过上调小鼠卵母细胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表达，进而提高卵母细胞质量。其机制可能为诱导BMP-15与其Ⅱ型受体BMPRⅡ形成复合物，然后募集Ⅰ型受体ALK6，并可能使其磷酸化而发生活化，活化的Ⅰ型受体进一步磷酸化细胞内信号因子Smad1/5/8，从而启动信号传导。高剂量组的效果优于低剂量组。3补肾调经方可通过上调小鼠卵母细胞中BMP-15mRNA及其蛋白的表达，进而提高卵母细胞质量。其机制可能为诱导BMP-15与其它Ⅱ型受体形成复合物，然后募集Ⅰ型受体ALK6，并可能使其磷酸化而发生活化，进一步活化细胞内信号因子Smad1/5/8，从而启动信号传导。高剂量组的效果优于低剂量组。4逍遥丸和补肾调经方均可改善小鼠卵母细胞质量，但影响BMP-15信号通路的环节有所不同。

补肾法、疏肝法对小鼠卵母细胞BMP-15及其Smads信号通路影响的研究

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