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纳米材料对小鼠肺毒性的研究和甲型H1N1流感病毒在人肺上皮细胞及雪貂中的致病性研究

作　者: 邓洁捷
导　师: 蒋澄宇
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 急性肺损伤 地塞米松 修饰化单壁碳纳米管 纤维化 NF-κB
分类号: R114
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


纳米技术已经是当今最重要及新兴的科技发展之一,但因为它的发展而导致的安全问题也引起了越来越多的关注。在它们的发展过程中对纳米材料在人体暴露和引起的环境问题方面的危害评估对于纳米材料将来的发展至关重要。本文所研究的纳米材料是具有可溶性的修饰化单壁碳纳米管(functionalized single-walled carbon nanotubes,f-SWCNTs)。碳纳米管(Carbon NanoTubes,CNT)是一种特殊形式的碳分子,是碳原子之间形成化学键组成的管状结构。单壁碳管(single-walled carbon nanotubes, SWCNT),由一层碳原子网组成,直径范围0.6～2.4nm；由于其特有的理化性质(重量较轻,较好的延伸性能,热力学/化学稳定性以及导电能力),碳纳米管被大量用于制造组织支架。同时,由于具有较大的表面积,表面可以被各种功能基团修饰而具有不同的功能,碳纳米管被广泛用于递送肽段、蛋白质、基因、药物或疫苗等[4]。本研究针对表面功能基团为AMIDE, COOH, PABS, PEG的单壁碳管在小鼠中的肺毒性做了评估并阐述了相关的分子机制,进一步检测了修饰化单壁碳纳米管处理后小鼠的自我修复能力和小鼠肺纤维化程度。在气管注射修饰化单壁碳纳米管18h或14d后,检测了小鼠肺组织病理、肺泡支气管灌洗液(Bronchial Alveolar Lavage Fluid, BALF)中细胞因子、肺血管通透性以及血氧分压,另外也做了免疫组化检测。我们发现部分修饰化单壁碳纳米管能在小鼠中通过MyD88-NF-κB信号通路能引起促炎性细胞因子风暴而造成急性肺损伤(Acute Lung Injury, ALI)。本研究中,我们也证实了皮质类固醇类药物能减轻修饰化单壁碳纳米管在小鼠中诱导的急性肺损伤。另外,单次给药14d后,小鼠的急性肺损伤几乎完全恢复正常,而同时轻度至中度的肺纤维化、肉芽肿、DNA损失在14d时仍然存在。综上所述,我们的研究为将来处理随着应用而不断增长的纳米材料安全性问题提供了可能的参考。背景：2009年在北美爆发了以一株新的猪源性甲型H1N1流感病毒造成的的流行性感冒[1,2,3],该病毒随后在人类中流行并短时间内传播至全世界大部分地区。然而此病毒在人呼吸道上皮细胞和哺乳动物中的致病机制仍然不清晰。实验方法及实验结果：在本研究中,我们发现一株从病人身上分离的2009年甲型H1N1流感病毒,A/Beijing/501/2009,能在雪貂中引起典型的流行性感冒症状,包括体重减轻、体温波动、肺组织病理变化。我们的研究也证实了人肺腺癌上皮细胞A549细胞对甲型H1N1流感病毒易感,同时被感染的细胞在早期即发生了凋亡。与季节性H1N1流感病毒相比,甲型H1N1流感病毒株A/Beijing/501/2009能在A549细胞中引起更多的细胞死亡,且细胞死亡方式是依赖caspase-3信号通路的凋亡。另外,感染了甲型流感A/Beijing/501/2009H1N1病毒株的雪貂表现出体温上升、体重下降更厉害、肺组织中病毒滴度更高等症状。因此,A/Beijing/501/2009型甲型H1N1流感病毒株能成功感染雪貂肺组织,并能造成比季节性流感病毒更严重的病理损伤。结论：本研究发现2009年甲型H1N1流感病毒与季节性H1N1流感病毒在体内和体外表现出不同的毒力,可能是通过不同的机制导致的。细胞凋亡参与甲型H1N1流感病毒造成的体外细胞病变、甲型H1N1流感病毒感染的雪貂肺组织中病理变化比季节性流感病毒更严重的这些发现拓宽了人类对甲型H1N1流感病毒在感染人类和动物的致病机制方面的知识。

全文目录


目录  3-11
第一部分 碳纳米管对小鼠肺毒性的研究  11-64
  中文摘要  12-13
  Abstract  13-14
  前言  14-18
  第一节 修饰化碳纳米管能通过产生促炎性细胞因子导致小鼠急性肺损伤  18-27
    1 实验材料  18
      1.1 实验动物  18
      1.2 纳米材料  18
      1.3 实验试剂  18
      1.4 实验设备  18
    2 实验方法  18-21
      2.1 碳纳米材料的处理  18-19
        2.1.1 材料溶液的配制  18-19
        2.1.2 修饰化碳纳米管溶液浓度的测定  19
      2.2 修饰化碳纳米管的电镜分析  19
      2.3 小鼠肺部病理切片检查及肺组织中炎性浸润细胞计数  19
      2.4 小鼠支气管肺泡灌洗液中炎症相关因子的测定  19-20
        2.4.1 小鼠支气管肺泡灌洗液的准备  19-20
        2.4.2 ELISA检测细胞因子步骤  20
      2.5 小鼠肺组织血管壁渗透性实验(Evans Blue实验)  20-21
      2.6 小鼠动脉血氧分压检测  21
    3 实验结果  21-27
      3.1 修饰化的碳纳米管的显微结构  21-23
      3.2 修饰化的碳纳米管处理18h后小鼠肺组织病理变化  23-24
      3.3 修饰化的碳纳米管给药18h后小鼠BALF中细胞因子含量上升  24-25
      3.4 AMIDE修饰化的碳纳米管给药18 h后引起小鼠肺组织血管渗透性增加  25-26
      3.5 AMIDE修饰化的碳纳米管给药18 h后引起小鼠肺动脉血氧分压下降  26-27
  第二节 修饰化碳纳米管通过MyD88-NFκB-cytokine信号通路导致小鼠急性肺损伤  27-39
    1 实验材料  27-28
      1.1 实验动物  27
      1.2 纳米材料  27
      1.3 实验试剂  27-28
        1.3.1 抗体  27
        1.3.2 化学试剂  27-28
      1.4 实验设备  28
    2 实验方法  28-34
      2.1 碳纳米材料的处理  28
        2.1.1 材料溶液的配制  28
        2.1.2 修饰化碳纳米管溶液浓度的测定  28
      2.2 NF-κB转基因小鼠验证实验  28-29
      2.3 小鼠肺泡中单核巨噬细胞中NF-κB和IκB-α的表达分析  29-33
        2.3.1 Western blotting样品准备  29
        2.3.2 主要溶液的配制  29-30
        2.3.3 Western blotting检测IκB-α的表达分析  30-31
        2.3.4 EMSA样品的制备  31-32
        2.3.5 EMSA所用溶液的配制  32
        2.3.6 EMSA检测NFκB的表达分析(参照Thermo公司说明书)  32-33
      2.4 Myd88基因敲除小鼠BALF中炎症相关因子的测定  33-34
      2.5 Tlr4基因敲除小鼠BALF中炎症相关因子的测定  34
    3 实验结果  34-39
      3.1 AMIDE修饰化的碳纳米管能引起NFκB-Luc转基因小鼠中荧光素酶的激活  34-35
      3.2 EMSA检测显示AMIDE修饰化的碳纳米管能增加小鼠肺组织核NFκB蛋白  35-36
      3.3 修饰化碳纳米管处理Myd88基因敲除小鼠能引起BALF中IL-6水平下降  36-37
      3.4 修饰化碳纳米管处理Tlr4基因敲除小鼠能引起BALF中IL-6水平下降  37-39
  第三节 皮质类固醇类激素可减轻修饰化碳纳米管导致的小鼠急性肺损伤  39-42
    1 实验材料  39
      1.1 实验动物  39
      1.2 纳米材料  39
      1.3 实验试剂  39
      1.4 实验设备  39
    2 实验方法  39-40
      2.1 碳纳米材料的处理  39-40
        2.1.1 材料溶液的配制  39-40
        2.1.2 修饰化碳纳米管溶液浓度的测定  40
      2.2 皮质类固醇类药物治疗对小鼠BALF中炎症细胞因子的影响  40
    3 实验结果  40-42
      3.1 药物处理能显著降低修饰化碳纳米管处理后小鼠BALF中IL-6含量  40-42
  第四节 检测碳纳米管引起的急性肺损伤自我修复,肺纤维化,肉芽肿以及DNA损伤  42-55
    1 实验材料  42-43
      1.1 实验动物  42
      1.2 纳米材料  42
      1.3 实验试剂  42
        1.3.1 抗体  42
        1.3.2 化学试剂  42
      1.4 实验设备  42-43
    2 实验方法  43-47
      2.1 碳纳米材料的处理  43
        2.1.1 材料溶液的配制  43
        2.1.2 修饰化碳纳米管溶液浓度的测定  43
      2.2 小鼠肺部病理切片检查及肺组织炎性浸润细胞计数  43-44
      2.3 小鼠肺部病理切片及马松染色检测  44-45
      2.4 小鼠肺部病理切片及免疫组化检测  45
      2.5 修饰化碳纳米管处理14 d后小鼠BALF中炎症相关因子的测定  45-46
        2.5.1 小鼠支气管肺泡灌洗液的准备  45-46
      2.6 修饰化碳纳米管处理14 d后小鼠肺组织血管壁渗透性实验  46-47
      2.7 修饰化碳纳米管处理14 d后小鼠动脉血氧分压检测  47
    3 实验结果  47-55
      3.1 修饰化的碳纳米管给药14 d后小鼠BALF中细胞因子水平恢复正常  47-48
      3.2 AMIDE修饰化的碳纳米管处理14 d后小鼠肺血管通透性恢复正常  48-49
      3.3 AMIDE修饰化的碳纳米管处理14 d后小鼠肺动脉血氧分压恢复正常  49-50
      3.4 修饰化的碳纳米管给药14 d后小鼠肺组织病理变化  50-52
      3.5 高剂量修饰化的碳纳米管给药14 d后能引起小鼠肺组织纤维化  52-53
      3.6 修饰化的碳纳米管给药后能引起小鼠肺组织DNA损伤  53-55
  结论  55-56
  讨论  56-58
  参考文献  58-64
第二部分 甲型H1N1流感病毒在人呼吸上皮细胞及雪貂中的致病性研究  64-97
  中文摘要  65-66
  Abstract  66-68
  前言  68-70
  第一节 甲型H1N1流感病毒的分离、培养、浓缩  70-73
    1 实验材料  70
      1.1 仪器  70
      1.2 试剂  70
      1.3 病毒来源  70
      1.4 病毒及载体  70
    2 实验方法  70-73
      2.1 活胚检查  70-71
      2.2 鸡胚尿囊腔接种  71
      2.3 甲型H1N1流感病毒的收获  71
      2.4 鸡胚尿囊液中病毒的粗离  71-72
      2.5 超速离心法浓缩流感病毒  72-73
  第二节 甲型H1N1流感病毒的血凝单位及50%培养组织感染剂量(TCID50)测定  73-76
    1 实验材料  73
      1.1 仪器  73
      1.2 试剂  73
      1.3 病毒  73
      1.4 细胞  73
    2 方法  73-76
      2.1 制备1%鸡红细胞悬液  73-74
      2.2 MDCK细胞的培养  74
      2.3 甲型H1N1流感病毒的血凝单位测定  74-75
      2.4 甲型H1N1流感病毒50%培养组织感染剂量(TCID50)的测定  75-76
  第三节 甲型H1N1流感病毒对A549细胞的毒性研究  76-85
    1 实验材料  76-77
      1.1 仪器  76
      1.2 试剂  76
      1.3 抗体  76-77
      1.4 病毒  77
      1.5 细胞  77
    2 实验方法  77-81
      2.1 主要溶液的配制  77-78
        2.1.1 细胞裂解液的配制  77
        2.1.2 SDS-PAGE蛋白质电泳及相关缓冲液的配制  77-78
      2.2 贴壁细胞培养  78
      2.3 MTS方法测定流感病毒对细胞活性的影响  78
      2.4 TUNEL方法检测细胞凋亡  78-79
      2.5 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白  79-81
        2.5.1 Western blotting样品准备  79
        2.5.2 Western blotting检测caspase-3、PARP蛋白质的表达  79-81
    3 实验结果  81-85
      3.1 甲型H1N1流感病毒对A549细胞活性影响的MTS实验  81-82
      3.2 甲型H1N1流感病毒诱导A549细胞发生凋亡  82-83
      3.3 甲型H1N1流感病毒处理A549细胞引起Caspase 3的剪切  83-85
  第四节 甲型H1N1流感病毒感染雪貂肺损伤模型的建立  85-92
    1 实验材料  85-86
      1.1 仪器  85
      1.2 试剂  85
      1.3 病毒  85
      1.4 动物  85-86
    2 实验方法  86-88
      2.1 甲型H1N1流感病毒致雪貂体重及体温变化  86
      2.2 甲型H1N1流感病毒感染雪貂后鼻甲膜、气管、肺脏、肝、脾、肾、脑组织中病毒的滴度测定  86-87
      2.3 甲型H1N1流感病毒致雪貂肺组织病理变化  87-88
    3 实验结果  88-92
      3.1 甲型H1N1流感病毒感染致雪貂体重变化  88
      3.2 甲型H1N1流感病毒感染致雪貂体温变化  88-89
      3.3 甲型H1N1流感病毒感染致雪貂肺组织病理变化结果  89-90
      3.4 甲型H1N1流感病毒感染后雪貂不同组织中病毒的滴度(TCID50)  90-92
  小结  92-93
  讨论  93-95
  参考文献  95-97
综述一 先天性免疫反应中Toll样受体的协同作用  97-117
  参考文献  108-117
综述二 探索丙型肝炎的治疗对策  117-128
  参考文献  123-128
个人简历  128-130
致谢  130-132

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中图分类: > 医药、卫生 > 预防医学、卫生学 > 卫生基础科学 > 卫生毒理
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