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大菱鲆消化系统及相关蛋白酶发生发育的研究

作　者: 迟良
导　师: 李军
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 大菱鲆胃蛋白酶胃质子泵胰蛋白酶早期发育
分类号: S917.4
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

消化酶是由消化腺和消化系统分泌的具有消化功能的酶类。消化酶对鱼类的生长发育及新陈代谢过程都起到重要的作用。由于海水鱼类的主要营养来源是蛋白质,因此蛋白酶是鱼类中最主要的消化酶类,其中胃蛋白酶和胰蛋白酶是最重要的两种蛋白消化酶。鱼类早期发育过程中,消化器官的发育及其功能化的过程对于鱼类的生产实践具有重要的指导作用,而蛋白酶的出现也是消化器官功能形成的一个重要的标志,因此,研究蛋白酶的起源发生过程对于了解鱼类的消化过程及消化机制有重要意义。大菱鲆(Scophthalmus maximus)属于鲽形目、鲆科,分布于大西洋北岸,自上世纪90年代引进我国,由于其生长迅速、抗病能力强,营养丰富等特点,目前已是我国重要的经济海水鱼类。本论文研究了大菱鲆消化道的发育及其消化生理的变化,同时结合对蛋白酶基因在发育过程中的起源及定位进行了研究具体,结果如下：1、大菱鲆的消化道在初孵仔鱼为一条未分化的线性消化管。当仔鱼开口之后(3DAH, days after hatching),消化道逐渐发育为口咽腔、食道、胃和肠等部分。食道在2DAH末端开始膨大,上皮细胞逐渐转换成柱状细胞,3DAH时膨大的部分逐渐发育成胃。胃腺在16DAH出现,标志着胃的组织结构发育完善。肠道在2DAH开始分化,3DAH时就分化出前中肠和后肠,至27日龄时基本发育完善。肝胰脏的原基在2DAH出现,并在3DAH出现酶原颗粒,肝胰脏在17日龄时基本发育完善。2、通过蛋白酶活性的检测发现：大菱鲆的胃蛋白酶活性出现的时间在22DAH(43.14±7.57U/prot),晚于胃腺出现的时间,表明胃的功能化与胃的组织学发育并不同步,胃的功能化要晚于组织学的发育。随后胃蛋白酶的活性随着个体的发育逐渐增加。大菱鲆胰蛋白酶在未受精卵及胚胎时期均能检测到其活性,并且在未受精卵的中胰蛋白酶的比活性最高(1320.66±55.63U/prot)在随着胚胎发育逐渐下降,至原肠期时降到最低(77.37±0.58U/prot)。然后又逐渐上升,到18DAH时达(1061.80±102.76U/prot),至22日龄时又迅速下降(213.60±59.65U/prot),此后保持在一个平稳的水平。3、克隆获得了大菱鲆胃蛋白酶原A(pepsinogen A, PGA)、胃蛋白酶原C(pepsinogen C, PGC) cDNA序列全长。并且使用RT-PCR及原位杂交检测了其在大菱鲆早期发育过程中的表达情况。对大菱鲆PGA(tPGA)、PGC(tPGC)蛋白序列分析发现,tPGC较tPGA更加保守,而tPGA在对蛋白底物的结合能力更强。通过RT-PCR及荧光定量PCR检测发现tPGA及tPGC均在22DAH开始表达,在消化道中,tPGA与tPGC均在食道末端与胃的贲门处开始表达。在表达量上,tPGC在发育早期的表达量较高,而tPGA在成鱼中的表达量较高。另外,在不同组织中,tPGA与tPGC在食道和胃的表达量最高,其次在卵巢和肌肉中也有微量的表达。4、克隆获得了大菱鲆胃质子泵基因(H+/K+ATPase)α亚基的cDNA全长序列。并且检测了其在早期发育过程中的表达情况,发现大菱鲆H+/K+ATPase的表达时序跟tPGA、tPGC的表达时序一致,都是在22DAH开始在食道末端和胃的贲门部位表达。5、克隆获得了大菱鲆胰蛋白酶原(Trypsinogen, TG)基因的cDNA序列全长。检测了其在大菱鲆早期发育过程中的表达情况,大菱鲆胰蛋白酶原基因(tTG)的表达贯穿于大菱鲆的整个发育过程。在不同时期发育的卵母细胞中均能检测到tTG的表达,受精后,tTG的表达量随着胚胎发育逐渐降低,至原肠期达到最低,此后逐渐上升,至25日龄左右时,表达量突然降低。tTG基因的表达量与胰蛋白酶活性的变化趋势基本一致。另外,通过对tTG在大菱鲆胚胎中的定位分析发现,在胚胎发育早期,tTG在胚胎中弥散表达,并且在卵黄囊的系膜上也有分布。至孵化期时,tTG的分布逐渐向消化道和头部位置集中。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目录  10-14
第一章文献综述  14-32
  1.1 鱼类消化系统的发育及功能  14-18
    1.1.1 鱼类消化道的发育及功能  14-18
      1.1.1.1 口咽腔  14-15
      1.1.1.2 食道  15
      1.1.1.3 胃  15-16
      1.1.1.4 肠  16-17
      1.1.1.5 幽门盲囊  17-18
  1.2 鱼类消化腺的发育及功能  18-31
    1.2.1 鱼类肝脏的发育及功能  18-19
    1.2.2 鱼类胰腺的发育及功能  19-20
    1.2.3 鱼类消化酶研究进展  20-30
      1.2.3.1 鱼类胃蛋白酶研究进展  20-26
      1.2.3.2 鱼类胰蛋白酶研究进展  26-30
    1.2.4 鱼类的酸性消化机制  30-31
  1.3 本论文研究目的和意义  31-32
第二章大菱鲆消化系统的组织学研究  32-41
  2.1 研究背景  32
  2.2 材料与方法  32-33
    2.2.1 受精卵的孵化及苗种培育  32-33
    2.2.2 样品的采集及组织切片  33
  2.3 结果  33-35
    2.3.1 大菱鲆口咽腔的个体发生过程  33
    2.3.2 大菱鲆食道的个体发生过程  33-34
    2.3.3 大菱鲆胃的个体发生过程  34
    2.3.4 大菱鲆肠的个体发生过程  34
    2.3.5 大菱鲆肝胰脏的个体发生  34-35
  2.4 讨论  35-36
  图版说明  36-41
第三章大菱鲆早期发育过程中蛋白酶的活性变化  41-47
  3.1 研究背景  41
  3.2 材料与方法  41-42
    3.2.1 受精卵的孵化及苗种培育  41
    3.2.2 样品的采集  41-42
    3.2.3 大菱鲆早期发育过程中消化酶的检测  42
      3.2.3.1 样品的处理  42
      3.2.3.2 酶活的测定  42
      3.2.3.3 数据统计  42
  3.3 试验结果  42-45
    3.3.1 胃蛋白酶  42-44
    3.3.2 胰蛋白酶  44-45
  3.4 讨论  45-47
第四章胃蛋白酶原基因(pepsinogen)及胃质子泵基因(H~+/K~+ATPase)在大菱鲆早期发育过程中的表达模式  47-76
  4.1 研究背景  47-48
  第一节大菱鲆胃蛋白酶原(pepsinogen)的克隆与表达模式研究  48-68
    4.2.1 材料与方法  48-54
      4.2.1.1 主要试剂和仪器  48-49
      4.2.1.2 大菱鲆受精卵的孵化与苗种培育  49
      4.2.1.3 样品的采集  49
      4.2.1.4 RNA的提取及cDNA第一链的合成  49-50
      4.2.1.5 大菱鲆胃蛋白酶原A、胃蛋白酶原C基因cDNA全长的克隆  50
      4.2.1.6 序列分析和进化树构建  50-51
      4.2.1.7 大菱鲆tPGA,tPGC表达模式分析  51-52
      4.2.1.8 原位杂交  52-54
    4.2.2 试验结果  54-65
      4.2.2.1 大菱鲆胃蛋白酶原A(tPGA)和胃蛋白酶原C(tPGC)的序列特征  54-56
      4.2.2.2 进化树构建及分析  56-58
      4.2.2.3 大菱鲆PGA和PGC的氨基酸序列比对及功能分析  58-59
      4.2.2.4 大菱鲆胃蛋白酶原A与胃蛋白酶原C在早期发育过程中及不同组织的表达情况  59-62
      4.2.2.5 tPGA和tPGC的在消化道的定位分析  62-65
    4.2.3 讨论  65-68
  第二节大菱鲆胃质子泵基因的表达模式研究  68-76
    4.3.1 材料与方法  68-69
    4.3.2 试验结果  69-74
      4.3.2.1 大菱鲆H~+/K~+ATPase α亚基cDNA全长序列分析  69-71
      4.3.2.2 大菱鲆H~+/K~+ATPase α亚基的序列比对及进化树构建  71
      4.3.2.3 H~+/K~+ATPase在大菱鲆发育不同时期及不同组织中的表达分析  71-74
    4.3.3 讨论  74-76
第五章胰蛋白酶原(trypsinogen)在大菱鲆早期发育过程中的表达模式  76-87
  5.1 研究背景  76-77
  5.2 材料与方法  77-78
    5.2.1 主要试剂和仪器  77
    5.2.2 样品的采集  77
    5.2.3 试验方法  77-78
  5.3 试验结果  78-85
    5.3.0 大菱鲆胰蛋白酶原基因(trypsinogen,TG)的序列特征  78-79
    5.3.1 大菱鲆胰蛋白酶原的进化树构建及氨基酸序列比对  79-81
    5.3.2 大菱鲆胰蛋白酶原早期发育过程中及不同组织的表达情况  81-83
    5.3.3 大菱鲆胰蛋白酶原基因在胚胎发育中的表达定位研究  83-84
    5.3.4 大菱鲆胰蛋白酶原基因在卵巢中的表达  84-85
  5.4 讨论  85-87
第六章结论与展望  87-89
  6.1 研究结论  87-88
  6.2 展望  88-89
参考文献  89-116
博士期间发表和完成的论文  116

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