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黄海绿潮浒苔（Ulva prolifera）遗传多样性研究

作　者: 赵瑾
导　师: 秦松
学　校: 中国科学院研究生院（海洋研究所）
专　业: 海洋生物学
关键词: 黄海绿潮浒苔种内遗传多样性生态型
分类号: S917.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

随着水体富营养化的日益严重，世界范围内，从北美、欧洲、亚洲到大洋洲沿海，近年来都不断有绿潮发生，给近岸生态环境和旅游经济造成日益严峻的负面影响。2007年以来，黄海海域也连年暴发大规模绿潮，其显著特征是：规模最大，漂移路径最长，造成损失惊人，且呈周期性暴发，已经形成一种稳定发生的海洋灾害。通过形态学观察和分子标记序列分析，黄海绿潮的优势种被鉴定为浒苔（Ulva prolifera=Enteromorpha prolifera），黄海绿潮系同一物种、也是单一物种的连续暴发。然而，浒苔在我国沿海分布广泛，物种水平的研究难以对绿潮藻的来源，绿潮的形成、暴发机制等问题给出答案。筛选适用于浒苔种内遗传多样性研究的分子标记，对不同年份、不同位点的黄海绿潮浒苔及沿海定生浒苔群体的遗传多样性与遗传距离进行分析，对于黄海绿潮藻的溯源及黄海绿潮形成机制的阐释都是十分必要的。由于当前在种群水平对绿潮藻的研究还比较少，缺少浒苔物种特异的、适用于种内遗传多样性研究的分子标记，而浒苔本身形态特征极不稳定，且由于黄海绿潮的暴发，地理种群之间的关系变得不确定，本文首先选择了地理种群信息明确、与浒苔同属的孔石莼（U. pertusa）为材料，对ISSR通用引物进行筛选，并对ISSR方法在石莼属绿藻种内遗传多样性研究中的适用性进行评估。在青岛、烟台、大连三个海域分别选取4个位点采集孔石莼种群样本，对采自12个位点的48个孔石莼单株进行遗传多样性分析。筛选出的4个ISSR引物共扩增出120条多态性条带。青岛地区孔石莼样本的遗传多样性相对于烟台和大连的孔石莼样本要高。所构建的系统发育树显示孔石莼样本之间的聚类关系与它们之间的地理距离有关。不同种群之间的基因流受到阻碍，即使是地理距离很近的孔石莼种群之间也存在遗传差异。对孔石莼不同地理种群的研究证明ISSR标记适用于石莼属绿藻的种内遗传多样性分析。用ISSR标记对2007–2009年的7个黄海绿潮浒苔样本（自由漂浮浒苔样本）和6个采自黄海和东海不同位点的定生浒苔群体样本进行遗传多样性和遗传距离分析，每个样本取4个单株，共分析了52个浒苔单株。结果显示漂浮样本的遗传多样性比定生样本的遗传多样性要低。UPGMA聚类分析及主坐标分析（PCoA）结果表明2007–2009年黄海绿潮浒苔具有高度的遗传相似性，而且黄海绿潮浒苔与所采集的定生浒苔不同。AMOVA分析表明定生浒苔群体之间的基因交流受到阻碍。基于黄海绿潮浒苔在遗传上的高度一致性，开发对黄海绿潮浒苔特异性的分子标记，用于黄海绿潮的日常监测和溯源研究。从绿潮浒苔和定生浒苔的ISSR图谱中找出绿潮浒苔特异的条带，并根据其序列，设计出对绿潮浒苔特异的引物，从而将ISSR标记转化为SCAR（sequence characterized amplified region）标记。从绿潮浒苔特异的ISSR条带中共设计出5对SCAR引物，但最终只有一对引物通过了2007–2010年的7个黄海绿潮浒苔样本和5个定生浒苔样本的验证，成为黄海绿潮浒苔特异性的分子标记。随着黄海绿潮相关研究的增多和深入，对于黄海绿潮的物种组成和遗传多样性，近两年来出现了一些新的认识。有研究认为早期的研究低估了黄海绿潮藻的物种多样性；也有研究认为黄海漂浮浒苔存在高度的遗传差异，黄海绿潮的形成经过了一个来自多个不同区域的绿潮藻的汇聚过程。对此，本文进一步对2007–2011五年来的黄海绿潮藻样本进行了物种水平和种内水平遗传多样性的研究。在物种水平，除了新补充的2010年和2011年的黄海绿潮藻样本，还广泛参考了现有文献中2007年到2009年所发表的182个黄海绿潮藻样本和155个沿海定生石莼属绿藻样本的信息。样本的形态特征和分子聚类分析结果表明，虽然我国北部沿海的定生石莼属绿藻存在一定的物种多样性，但五年来黄海绿潮的优势物种相同且单一，均为浒苔（U. prolifera）。在浒苔种内水平，广泛采集了五年黄海绿潮浒苔样本（14个群体样本，共56个单株）和我国沿海定生浒苔样本（9个群体样本，共36个单株），分析其遗传多样性和不同群体间的遗传关系。ISSR图谱的分子系统发育分析和黄海绿潮浒苔特异性SCAR标记的扩增结果证明过去五年黄海绿潮浒苔具有高度的遗传相似性，且黄海绿潮浒苔与所有的定生浒苔样本均不相同。另一方面，黄海绿潮浒苔相对于定生浒苔有其特殊的表型特征，如更加密集的分枝、更快的生长速率、更强的抗逆性，这些特征与其适应在海面自由漂浮生长的生活环境是密切相关的。由此，本文认为五年来黄海绿潮是由浒苔的一个新的生态型——自由漂浮型（thefree-floating type）所构成。这一观点的提出，对于寻找黄海绿潮浒苔的来源、阐明黄海绿潮形成及暴发的机制、解释黄海绿潮每年周而复始循环发生的原因都有重要意义。

全文目录

致谢  5-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
目录  13-15
第一章绪论  15-38
  1.1 绿潮暴发已成为世界性的海洋生态问题  15-25
    1.1.1 绿潮的分布  15-17
    1.1.2 绿潮的形成原因  17-19
      1.2.2.1 绿潮藻自身的生物学特点  17-18
      1.2.2.2 环境因素  18-19
    1.1.3 绿潮的危害  19-20
    1.1.4 绿潮藻物种鉴定与遗传多样性研究进展  20-25
      1.1.4.1 分子生物学技术为绿潮藻的物种鉴定提供了有力工具  20-25
      1.1.4.2 绿潮藻种内遗传多样性及种群遗传结构的研究还很少  25
  1.2 黄海绿潮已成为一种稳定发生的海洋灾害  25-36
    1.2.12 007 – 2011 年黄海绿潮的相关情况  25-28
    1.2.2 黄海绿潮的特点  28-29
    1.2.3 黄海绿潮藻的物种鉴定  29-31
    1.2.4 黄海绿潮浒苔的生活史研究  31-34
    1.2.5 黄海绿潮浒苔生理学研究  34-35
    1.2.6 黄海绿潮藻的溯源研究  35
    1.2.7 黄海绿潮形成机制研究  35-36
    1.2.8 绿潮藻资源化利用相关研究  36
  1.3 本论文的研究内容、目的及意义  36-38
第二章 ISSR 方法在石莼属种内遗传多样性研究中的有效性验证——孔石莼（Ulva pertusa）种群遗传多样性的 ISSR 分析  38-51
  2.1 引言  38-39
  2.2 材料方法  39-42
    2.2.1 样本采集  39-41
    2.2.2 DNA 提取  41
    2.2.3 ISSR 扩增  41
    2.2.4 扩增条带的可视化与数字化  41-42
    2.2.5 数据分析  42
  2.3 结果  42-49
    2.3.1 ISSR 引物筛选与对孔石莼样本的扩增  42-43
    2.3.2 孔石莼样本遗传多样性评估  43
    2.3.3 聚类分析  43-47
    2.3.4 分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）  47-49
  2.4 讨论  49-51
第三章 2007 – 2009 年黄海绿潮浒苔（Ulva prolifera）种内遗传多样性初步分析  51-64
  3.1 引言  51-52
  3.2 材料方法  52-55
    3.2.1 样本采集  52
    3.2.2 DNA 提取  52-53
    3.2.3 ISSR 扩增与电泳  53-54
    3.2.4 数据分析  54-55
  3.3 结果  55-62
    3.3.1 ISSR 扩增  55-56
    3.3.2 浒苔样本遗传多样性的评估  56-57
    3.3.3 聚类分析  57-60
    3.3.4 主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）  60-61
    3.3.5 定生浒苔群体样本的 AMOVA 分析  61-62
  3.4 讨论  62-64
第四章黄海绿潮浒苔（Ulva prolifera）特异性 SCAR 标记的开发  64-72
  4.1 引言  64-65
  4.2 材料与方法  65-67
    4.2.1 样本采集  65
    4.2.2 基因组 DNA 提取  65
    4.2.3 ISSR 分析  65-66
    4.2.4 SCAR 引物设计与检验  66-67
  4.3 结果  67-70
    4.3.1 SCAR 标记的开发  67-68
    4.3.2 对备选 SCAR 标记的特异性在不同浒苔样本中进行检验  68-70
    4.3.3 SCAR 标记 Flo_55L 的特异性在石莼属近缘物种中的检验  70
  4.4 讨论  70-72
第五章 2007 – 2011 五年黄海绿潮是由浒苔（Ulva prolifera）一种新的生态型所构成  72-99
  5.1 引言  72-74
  5.2 材料与方法  74-83
    5.2.1 样本采集  74-76
    5.2.2 黄海绿潮藻的物种鉴定  76-81
    5.2.3 黄海绿潮浒苔样本与沿海定生浒苔样本的 ISSR 分析  81-82
    5.2.4 黄海绿潮浒苔与沿海定生浒苔样本的 SCAR 标记检测  82-83
  5.3 结果  83-95
    5.3.1 黄海绿潮藻物种鉴定结果  83-85
    5.3.2 黄海绿潮浒苔遗传多样性分析  85-95
      5.3.2.1 ISSR 扩增结果  85-88
      5.3.2.2 黄海绿潮浒苔与沿岸定生浒苔遗传多样性评估  88-89
      5.3.2.3 聚类分析  89-92
      5.3.2.4 主坐标分析（PCoA）  92-94
      5.3.2.5 定生浒苔群体样本的分子方差分析  94
      5.3.2.6 特异性 SCAR 标记在浒苔样本中的扩增结果  94-95
  5.4 讨论  95-99
    5.4.1 五年黄海绿潮的优势物种均为浒苔  95-96
    5.4.2 黄海绿潮浒苔是浒苔一种新的生态型  96-99
主要结论  99-100
参考文献  100-115
完成和发表论文情况  115

黄海绿潮浒苔（Ulva prolifera）遗传多样性研究

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