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草鱼生长相关SNPs的筛选和群体的遗传结构分析

作　者: 曹婷婷
导　师: 白俊杰
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: ALDOB CPA1 体质量遗传结构
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

草鱼(Ctenopharyngodon idella)，隶属于鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），雅罗鱼亚科（Leuciscus），草鱼属（Grass carp）。具有生长快，肉质鲜美，养殖成本低等优点，是我国淡水渔业中最重要的养殖品种之一。但是，草鱼目前还没有遗传改良品种。利用DNA遗传标记进行辅助选育已成为动物育种过程中的重要方法。通过传统选育与分子选育相结合的方法，选育开发草鱼基础种群，以此大大缩短良种选育周期，促进中国草鱼养殖业的健康发展。本研究在草鱼EST-SNPs数据文库中选取醛缩酶B和羧肽酶A1基因序列片段上预计存在的SNP位点进行验证并分析，将所获得的SNP位点的不同基因型与草鱼的生长性状进行关联分析。同时将在EST库中筛到的其他7个SNP位点用于对我国的六个草鱼群体（湖南宁乡群体、湖南沅江群体、湖北监利群体、湖北石首群体、广东南庄群体和湖北洪湖群体）的遗传结构进行分析。具体研究内容如下：1.醛缩酶B基因和羧肽酶A1基因的SNP多态性及其与生长性状的关联分析根据草鱼EST库的醛缩酶B基因和羧肽酶A1基因重叠群的Contig设计引物扩增这两个基因的序列片段，采用直接测序法和序列比对，在醛缩酶B基因上共筛到3个颠换SNP位点：C+687G，C+1042A，A117C。在羧肽酶A1基因上共筛到2个颠换SNP位点：C+412A和A36C。采用SnaPshot的方法分别对同一群体的296尾草鱼的这5个位点进行检测和分型，统计基因型频率。利用一般线性模型分析5个SNPs位点与草鱼体质量、体长等重要生长性状的关系。关联分析结果显示：在醛缩酶B基因上，A117C和C+1042A两个位点都和体质量等重要生长性状显著相关（P<0.05），C+687G位点不同基因型和体质量等重要生长性状不相关。将3个SNPs位点不同基因型两两位点组成3个组合的双倍型：C+687G和A117C以及C+687G和C+1042A的2个组合分别组成的7种双倍型在体质量等5个生长性状上都存在显著差异（P<0.05）；A117C和C+1042A组成的3种双倍型在体质量、眼间距这2个生长性状上都存在显著差异（P<0.05）。在羧肽酶A1基因上，A36C位点的不同基因型和体质量、眼间距等生长性状显著相关（P<0.05）。C+412A位点在体质量等生长性状上差异不显著(P>0.05)，该位点和生长不相关。两个位点共组成了D3、D5、D6、D7和D8五种双倍型。其中，D3和D5在质量上存在显著差异(P<0.05)；双倍型D3和D8在体质量、体宽、体长和体长/头长等生长性状上都存在显著差异(P<0.05)。2、利用7个SNP位点对不同群体的遗传结构分析通过草鱼的EST-SNP数据库设计引物扩增醛缩酶B、胰弹性蛋白酶和胰凝乳蛋白酶3个预计存在的SNP位点基因部分序列，采用直接测序和序列比对共获得7个SNP位点，分别命名为：A2259G、C+468T、A+567T、A60G、G+641C、T+507G和C+513T。采用SnaPshot的方法对这7个位点在292尾养殖草鱼中进行分型，统计基因型和频率。并用所检测到的这7个SNP位点对我国的六个草鱼群体（湖南宁乡群体、湖南沅江群体、湖北监利群体、湖北石首群体、广东南庄群体和湖北洪湖群体）的遗传结构进行分析。结果显示：六个草鱼群体的平均多态信息含量（PIC）的范围在0.2046~0.3120之间，平均观测杂合度为（Ho）0.2743~0.3207，平均期望杂合度为（He）1.5332~1.6835，表明草鱼群体的遗传多样性偏低。其中，南庄群体的遗传多样性最高，沅江群体的遗传多样性最低。对这6个群体多态性的F-检验的结果也表明，草鱼群体间的遗传分化程度低；Hardy-Weinberg平衡的卡方检验结果表明，6个群体均在一定程度上偏离了平衡。这个结果为我们以后挑选良种育种，奠定了基础。我们在选取不同地域草鱼群体进行良种选择的时候，可以尽量选取南庄群体等遗传多样性高的群体，避免选择沅江等遗传多样性低的群体，以此缩短草鱼育种进程。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-25
  前言  12
  1.1 草鱼的遗传多样性的研究概况  12-18
    1.1.1 形态学标记水平  13
    1.1.2 蛋白标记水平  13-14
      1.1.2.1 同工酶技术在草鱼遗传结构上的研究进展  13-14
    1.1.4 DNA 分子标记水平  14-18
      1.1.4.1 RFLP 技术在草鱼遗传结构上的研究进展  14-15
      1.1.4.2 SSR 技术在草鱼遗传结构上的研究  15-16
      1.1.4.3 RAPD 技术在草鱼遗传结构上的研究  16-17
      1.1.4.4 SRAP 的分子标记技术在草鱼遗传结构上的研究  17-18
  1.2 单核苷酸多态性的研究进展  18-23
    1.2.1 单核苷酸多态性 DNA 标记  18-23
      1.2.1.1 SNP 的定义及特点  18-19
      1.2.1.2 SNPs 在水生动物遗传多样性的研究应用  19-21
      1.2.1.3 SNP 用于生长性状的关联分析的研究  21-23
  1.3 本研究的意义及技术路线  23-25
    1.3.1 目的与意义  23
    1.3.2 技术路线  23-25
      1.3.2.1 草鱼生长相关的 SNP 标记的筛选  23-24
      1.3.2.2 草鱼群体的遗传多样性分析  24-25
第二章草鱼醛缩酶B基因部分序列的SNP多态性及其与生长性状的关联分析  25-37
  2.1 材料与方法  25-28
    2.1.1 样品来源  25-26
    2.1.2 主要试剂和材料  26
    2.1.3 引物设计  26-27
    2.1.4 SNP 位点的筛选  27
    2.1.5 SNP 位点的分型  27
    2.1.6 数据统计分析  27-28
  2.2 结果与分析  28-35
    2.2.1 醛缩酶 B 基因部分序列的扩增  28
    2.2.2 醛缩酶 B 基因部分序列的 SNP 位点的获得和分析  28-29
    2.2.3 醛缩酶 B 基因3个 SNP 位点在草鱼群体中的多态性分析  29-30
    2.2.4 草鱼醛缩酶 B 基因3个 SNP 位点的多态性与草鱼生长性状关联分析  30-35
  2.3 讨论  35-37
第三章草鱼羧肽酶 A1 基因部分片段的 SNP 多态性及其与生长性状的关联分析  37-46
  3.1 材料与方法  37-40
    3.1.1 实验材料  37-38
    3.1.2 草鱼基因组 DNA 的提取  38
    3.1.3 引物设计  38
    3.1.4 PCR 扩增和 SNP 位点的筛选  38-39
    3.1.5 SNP 位点的分型  39-40
    3.1.6 数据统计分析  40
  3.2 结果与分析  40-44
    3.2.1 羧肽酶 A1 基因序列的扩增  40
    3.2.2 羧肽酶 A1 基因部分序列的突变位点的获得和密码子的分析  40-41
    3.2.3 羧肽酶 A1 基因的2个 SNP 位点在草鱼群体中的分布  41-42
    3.2.4 草鱼羧肽酶 A1 基因 SNP 位点与草鱼生长性状关联分析  42-44
  3.3 讨论  44-46
第四章草鱼 SNP 位点的筛选和六个群体的遗传结构分析  46-57
  4.1 材料与方法  46-49
    4.1.1 实验材料  46-47
    4.1.2 实验方法  47-49
      4.1.2.1 草鱼基因组 DNA 的提取  47
      4.1.2.2 引物设计  47-48
      4.1.2.3 PCR 扩增和 SNP 位点的筛选  48
      4.1.2.4 SNP 位点的分型  48
      4.1.2.5 数据统计与分析  48-49
  4.2 结果与分析  49-55
    4.2.1 三个基因部分序列的扩增  49
    4.2.2 突变位点的获得和密码子的分析  49-50
    4.2.3 SNP 位点的群体结构和遗传多样性分析  50-55
      4.2.3.1 SNP 位点的基因型分布  50-52
      4.2.3.2 遗传多样性分析与哈代-温伯格平衡  52-54
      4.2.3.3 群体间的遗传结构分析  54-55
  4.3 讨论  55-57
全文总结  57-58
参考文献  58-65
致谢  65-66
附录 1 中英文对照缩略词表(Abbreviations)  66-68
附录 2 攻读硕士学位期间发表的论文  68
  攻读硕士期间发表文章如下  68

草鱼生长相关SNPs的筛选和群体的遗传结构分析

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