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基因2型牛病毒性腹泻病毒的分离与鉴定

作 者: 孙宏进
导 师: 朱国强
学 校: 扬州大学
专 业: 兽医
关键词: 牛病毒性腹泻病毒 流行病学 RT-PCR 5’-UTR Npro E2 NS2-3
分类号: S858.23
类 型: 博士论文
年 份: 2010年
下 载: 34次
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内容摘要


牛病毒性腹泻病(BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(BVDV)引起牛以腹泻,急、慢性黏膜病,持续性感染,母畜流产、死胎和畸形胎等为临床特征的一种重要的传染病。BVDV呈世界性分布,其宿主谱相当广,除了可以感染各个年龄段的牛之外,还能感染猪、绵羊、山羊、鹿、骆驼及多种野生动物,且其易感动物群正呈逐渐扩大的趋势。BVDV有两个基因型,即BVDV-1和BVDV-2。BVDV-1的发现早,分布比较普遍,流行于世界各个国家,而BVDV-2在20世纪80年代末才首次分离于加拿大和美国爆发的急性BVD中。BVDV-1和BVDV-2感染表现的临床症状很相似,但BVDV-2还能引起严重的血小板减少症和出血综合症。我国在1980年首次分离报道了BVDV-1,随后在各地区都相继报道了该病毒的感染,目前,已有二十多个省市报道,说明BVDV-1在我国牛群流行普遍。2009年,我们实验室首次分离报道了BVDV-2,说明BVDV-2也开始出现在我国并可能流行。目前为止,关于BVDV-2在我国流行的详实情况还不是很清楚,该方面数据比较少。因此,本研究将集中如下三部分:一、目前国内BVDV的流行病学调查;二、对BVDV分离株的特性进行研究;三、对BVDV分离株进行基因测序分析及分型。上述研究旨在为目前我国牛病毒性腹泻病毒的流行提供资料,丰富该方面的数据,为进一步研究针对BVDV-1和BVDV-2的疫苗奠定基础。研究一:从我国各省不同地区的养牛场采集疑似BVDV感染牛的临床病料组织(脾、淋巴结、心肌、血液等),共127份。将样品初步处理后,用我们实验室建立的双抗夹心ELISA检测抗原。经ELISA检测为阳性的样品接种于MDBK细胞,进行病毒分离。样品在MDBK细胞上经3次传代后取提RNA,设计针对BVDV-1、BVDV-2和针对BVDV-1和BVDV-2两型的特异性引物,用我们实验室建立的RT-PCR方法进行鉴定。结果表明,在所检测的样品中,BVDV-2阳性11份(8.66%),所检病料中没有检出BVDV-1。上述研究表明,BVDV-2在我国牛群中已有广泛流行。研究二:经检测为BVDV2阳性的病料样品接种MDBK细胞,获得11株BVDV-2野毒株。分离到的11株BVDV-2分别盲传培养至18代时仍不见任何典型的细胞病变。间接免疫荧光试验证明分离的野毒株能与鼠源的重组BVDV-2E2蛋白抗血清发生免疫反应,产生特异性胞内荧光;而与针对BVDV-1E2蛋白的单抗不发生反应。将病毒感染的MDBK细胞制备超薄切片,电镜观察可见感染细胞的内质网中有约60nm大小的病毒粒子;经差速离心和20%蔗糖垫底超速离心纯化病毒,将提纯的病毒经磷钨酸染色,在电镜下能观察到大小约60nm有囊膜的病毒颗粒。研究三:提取病毒RNA,并反转录为cDNA。设计针对BVDV5’-UTRNpro、 E2和NS2-3的引物,以cDNA为模板分别扩增分离株的5’-UTR、Npro、E2和NS2-3基因片段。采用“TA”克隆法,将所扩增的片段连接到PMD18-T Vector上,经转化筛选出阳性克隆,并送去测序。通过5’-UTR序列进化树分析,结果表明11株分离株均为BVDV-2。比较这11株分离株的Npro、E2和NS2-3基因与GenBank中已发表的BVDV序列的同源性,结果表明,我们的这11株分离株的Npro、E2和NS2-3基因与890、XJ-04、p11Q、p24515、NewYork’93、NADL、Osloss、CD7、1373、 SD-1、KS86-lncp、Oregon C24V毒株的E2和NS2-3基因的核苷酸同源性分别为93.1%-67.1%,92.2%-63.2%,91.7%-64.2%,且这11株分离株均与XJ-04株(国内最早分离株)亲缘性最近。

全文目录


中文摘要  3-5
Abstract  5-11
第一章 文献综述  11-27
  1. BVDV的概述  11-12
  2. BVDV形态和理化学特性  12
  3 BVDV分子生物学特点  12-15
    3.1 BVDV基因组结构  12-13
    3.2 BVDV蛋白结构与功能的研究  13-15
  4. BVDV的分子流行病学  15-16
  5. BVDV流行原因分析  16-17
    5.1 BVDV基因型的多样性  17
    5.2 BVDV在流行病学方面的复杂性  17
    5.3 交叉感染  17
  6. BVDV的临床症状及致病机理  17-20
    6.1 持续感染与免疫耐受  17-18
    6.2 粘膜病  18
    6.3 繁殖障碍  18-19
    6.4 免疫抑制  19
    6.5 血小板减少症  19-20
  7. BVDV诊断技术研究进展  20-23
    7.1 抗体诊断  20-21
    7.2 抗原诊断方法  21-23
  8. 我国BVDV的研究进展  23-26
    8.1 国内牛病毒性腹泻病的流行病学  23-26
  9. 本研究的目的及意义  26-27
第二章 牛病毒性腹泻病毒的流行病学调查  27-37
  1. 材料  28-30
    1.1 样品来源和处理  28
    1.2 细胞系和毒株  28-29
    1.3 主要试剂  29
    1.4 仪器设备  29
    1.5 引物  29-30
  2. 方法  30-33
    2.1 双抗夹心ELISA方法  30
    2.2 MDBK细胞的培养条件与传代  30-31
    2.3 病毒的增殖  31
    2.4 样品RT-PCR检测  31-33
  3. 结果  33-36
    3.1 双抗夹心ELISA检测抗原  33
    3.2 疑似BVDV样品的RT-PCR检测  33-36
  4. 讨论  36-37
第三章 分离株的生物特性研究  37-42
  1. 材料  37-38
    1.1 毒株、细胞系  37-38
    1.2 细胞培养基及主要试剂  38
    1.3 主要仪器设备  38
  2. 方法  38-39
    2.1 病毒的传代培养  38
    2.2 间接免疫荧光实验(IFA)  38-39
    2.3 细胞培养物超薄切片的制备及负染电镜观察  39
  3. 结果  39-40
    3.1 病毒在细胞上的病变观察  39
    3.2 间接免疫荧光试验  39
    3.3 病毒负染电镜观察  39-40
  4. 讨论  40-42
第四章 分离株基因组测序分析及基因分型  42-53
  1. 材料  43-44
    1.1 分离株  43
    1.2 试剂、载体和菌种  43
    1.3 引物  43-44
  2. 方法  44-46
    2.1 病毒模板的制备  44
    2.2 PCR扩增  44
    2.3 琼脂糖凝胶电泳  44-45
    2.4 PCR产物的纯化  45
    2.5 PCR产物的克隆  45-46
    2.6 基因序列测定  46
    2.7 基因序列的剪接与分析  46
  3. 结果  46-52
    3.1 分离株5'-UTR、NproE2NS2-3基因的扩增  46-49
    3.2 5’-UTR、Npro、E2和NS2-3基因序列的测定及分析  49-52
      3.2.1 进化树分析  49-50
      3.2.2 N~(pro)、E2和NS2-3基因序列的同源性比较  50-52
  4. 讨论  52-53
全文总结  53-54
参考文献  54-63
致谢  63-64
论文发表或获奖情况  64-65

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 >
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