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一种新型白消安制备精原干细胞移植受体方法对小鼠生殖及生理功能的影响

作　者: 王琛
导　师: 黎宗强
学　校: 广西大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 白消安精原干细胞移植受体制备
分类号: S814
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

精原干细胞(SSCs)是维持雄性生殖能力的重要资源,也是精子发生的基础。精原干细胞移植为研究精子发生、雄性生殖能力及新型转基因技术奠定了基础。受体制备是SSCs移植技术的重要组成部分,也是SSCs成功移植的必要条件和前提基础,受体制备效率直接关系到移植效果。因操作方法简便,腹腔注射白消安一直是本研究领域中一种较为常用的方法,但白消安的副作用较大,严重时会引起动物死亡,影响了该方法的临床应用与发展。本研究通过直接向小鼠靶器官睾丸注射白消安来制备受体,同时以传统的腹腔注射作为对照,以50%DMSO睾丸注射作为空白对照,观察经不同途径给药后各组小鼠在不同时间点各项生殖生理指标(死亡率、体重和睾丸重、血象、精子数、曲细精管、GDNF、生育能力)的变化情况,分析不同给药途径对受体制备效果的影响。本研究发现经睾丸给药的小鼠没有出现死亡,而经腹腔给药后三组小鼠分别出现18%、39.3%、42.7%的死亡率。检测小鼠血常规发现,腹腔对照组小鼠除平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)无明显变化外,红细胞数(RBC)、血红蛋白数(HGB).白细胞(WBC)、血小板(PLT)均明显下降。而睾丸注射各组小鼠的RBC、HGB、MCHC均未发生明显变化,WBC、PLT数有所下降,但下降程度比腹腔对照组小,且各项血液指标均较快恢复到正常水平。40mg/kg剂量腹腔注射和6、8、10mg/kg剂量睾丸注射能够使受体曲细精管完全中空,而4mg/kg剂量不能使受体睾丸曲细精管内的生精细胞完全耗竭。虽然8mg/kg和10mg/kg剂量睾丸注射能够使曲细精管完全中空,但会造成睾丸硬化,恢复缓慢,甚至不能恢复。精子数、相对睾丸重量、GDNF水平会随着曲细精管内的变化发生相应改变。此外,经腹腔和睾丸注射白消安均会造成小鼠的短期不育,但这种不孕均可恢复,且睾丸注射比腹腔注射恢复速度更快。白消安在一定时期内虽然会对小鼠的生育能力造成影响,但不影响其后代性别比例。本研究以小鼠为模型,证明了双侧睾丸注射白消安对动物机体毒害作用显著低于腹腔注射,可以用于精原干细胞移植受体制备。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
常用缩写词中英文对照表  9-10
第一章文献综述  10-15
  1.1 精原干细胞移植前受体动物的准备  10-12
    1.1.1 白消安法  10-11
    1.1.2 局部射线照射法  11
    1.1.3 热处理法  11-12
    1.1.4 采用无内源性精子发生动物法  12
  1.2 立题依据  12-14
  1.3 研究内容  14-15
第二章材料与方法  15-23
  2.1 实验动物  15
  2.2 主要试剂、耗材  15
  2.3 主要仪器设备  15-16
  2.4 试剂配制  16
  2.5 药物注射  16
  2.6 样品采集  16-17
    2.6.1 血样采集  17
    2.6.2 睾丸、附睾采集  17
    2.6.3 精子采集  17
  2.7 石蜡切片制作  17-18
  2.8 切片H.E染色  18-19
  2.9 荧光定量PCR  19-22
    2.9.1 引物设计  19-20
    2.9.2 RNA提取  20
    2.9.3 DNase Ⅰ消除样品中的DNA  20
    2.9.4 RNA琼脂糖凝胶电泳  20-21
    2.9.5 荧光定量PCR检测  21
    2.9.6 RT-PCR(REAL TIME PCR)  21-22
  2.10 窝产仔数、性别记录  22
  2.11 数据分析  22-23
第三章结果与分析  23-57
  3.1 不同途径给药后小鼠死亡情况  23-24
  3.2 血液检测  24-36
  3.3 相对睾丸重  36-41
  3.4 精子数  41-44
  3.5 组织学分析  44-49
  3.6 白消安处理后,受试动物睾丸GDNF表达检测分析  49-52
  3.7 生育能力  52-57
第四章讨论  57-62
  4.1 血液检测  57-58
  4.2 相对睾丸重量  58
  4.3 精子数  58
  4.4 组织学分析  58-59
  4.5 GDNF mRNA表达水平  59
  4.6 生育能力  59-62
第五章结论  62-63
参考文献  63-66
致谢  66-67
攻读学位期间发表论文情况  67

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