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4种观赏竹花叶色素组成、结构分析及相关调控基因的研究

作　者: 王啸晨
导　师: 高志民
学　校: 中国林业科学研究院
专　业: 林木遗传育种
关键词: 观赏竹花叶叶绿体变异叶绿素合成原叶绿素酸酯氧还酶
分类号: S795
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物叶片常因具有独特的斑纹而使其观赏价值倍增，观叶竹种的叶片具有白色或黄色条纹使其成为园林绿化中的重要材料之一。为探讨观赏竹叶条状斑纹的成因，本研究以白纹阴阳竹（Hibanobambusa tranquillans f. shiroshima H.Okaura）、白纹椎谷笹（Sasaellaglabra f. albo-striata Muroi）、菲黄竹（Sasa auricoma E. G. Camu）、黄条金刚竹（Pleioblaseuskongosanensis f. aureo-striatus Muroi et Yuk）等4种观赏竹为材料，对其主要的色素组成、叶片形态、结构特征进行分析，并在此基础上对竹子叶绿素生物合成关键酶基因进行了克隆和功能研究，以期为揭示观赏竹花叶形成的机理奠定基础，为竹类植物良种选育的提供参考。主要研究结果如下：第一，主要色素组成分析。叶绿素和类胡萝卜素总含量分析结果显示，4种竹子叶片变色区的叶绿素和类胡萝卜素含量均降低，表明其光合色素的生物合成受阻。RP-HPLC分析显示表明，4种竹子绿色区叶片和变色区叶片的黄酮类物质的主要吸收峰的出峰时间和峰型趋于一致，表明各种物质的组成基本相同，这意味着花叶中黄酮类合成代谢可能对叶片的颜色没有影响。第二，叶片形态与结构分析。采用石蜡切片和超薄切片对有颜色差异的叶片结构进行比较观察，结果表明白纹阴阳竹和白纹椎谷笹叶片绿、白条带区域的表皮细胞之间无明显差异；而白色区叶片的叶肉细胞则呈现不同程度的叶绿体变异（基粒片层降解、产生嗜锇颗粒等）；菲黄竹和黄条金刚竹不同颜色区的叶片在显微结构和超显微结构却没有观察到明显差异。说明叶绿体的结构变异可能是导致白纹阴阳竹和白纹椎谷笹花叶形成的重要因素，而不是菲黄竹和黄条金刚竹花叶形成的主要原因。第三，原叶绿素酸酯氧还酶（POR）基因克隆与分析。采用RT-PCR方法，获得白纹阴阳竹、白纹椎谷笹、菲黄竹和黄条金刚竹的POR基因的编码区（ORF）序列，长度均为1185bp，共编码394个氨基酸，其中N端的58个氨基酸为导肽，成熟蛋白为336个氨基酸；分别命名为HtPOR、SgPOR、SaPOR和PkPOR。同源性分析显示竹子成熟蛋白区氨基酸序列高度同源。采用相同的引物，以4种竹子基因组DNA为模板，扩增获得POR基因编码区的基因组序列。序列分析显示4种竹子的POR编码区的基因组序列均由4个外显子和3个内含子组成。第四，HtPOR体外表达与活性鉴定。将HtPOR编码成熟蛋白的序列连入表达载体pMAL-P5X，转入大肠杆菌（Escherichia coli）菌株ER2523中，经IPTG诱导体外表达，获得了高丰度的可溶性融合蛋白；经过Amylose亲和树脂纯化后，能够获得浓度约为1mg·mL^-1的纯化蛋白。建立体外酶促反应体系来鉴定蛋白的活性，结果显示在室温光照条件下，pH为7.2的反应体系中，HtPOR融合蛋白能够催化原叶绿素酸酯（Pchlide）转变为叶绿素酸酯（Chlide），具有生物活性。第五，Western Blotting分析。以纯化后的HtPOR融合蛋白为抗原免疫兔子，获得多克隆抗体；以Anti-MBP-HtPOR抗体为一抗，对白纹阴阳竹的花叶不同部位组织进行Western Blotting分析。结果显示，在叶片绿色区组织中检测到POR蛋白积累，而叶片白色区组织中未检测到POR蛋白。不同部位组织中POR表达的差异，进一步证明叶绿体片层结构不完整是白纹阴阳竹花叶的叶绿素生物合成受到抑制的原因之一。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-15
第一章绪论  15-26
  1.1 引言  15-23
    1.1.1 研究背景  15-16
    1.1.2 国内外文献综述  16-23
  1.2 研究目标和主要内容  23-26
    1.2.1 研究目标  23-24
    1.2.2 研究主要内容  24-25
    1.2.3 研究技术路线图  25-26
第二章观赏竹色素组成分析  26-35
  2.1 材料和方法  26-28
    2.1.1 材料  26
    2.1.2 主要试剂  26
    2.1.3 叶绿素 a、b 及类胡萝卜素含量测定  26-27
    2.1.4 δ-ALA 及 PBG 含量测定  27
    2.1.5 标准曲线绘制  27
    2.1.6 黄酮类物质比较分析  27-28
  2.2 结果与分析  28-33
    2.2.1 不同颜色叶片光合色素含量比较  28-29
    2.2.2 δ-ALA 与 PBG 含量测定  29-30
    2.2.3 黄酮类物质组成比较  30-33
  2.3 小结  33-35
第三章观赏竹的花叶结构  35-41
  3.1 材料和试剂  35
    3.1.1 植物材料  35
    3.1.2 实验试剂  35
  3.2 实验方法  35-36
    3.2.1 石蜡切片样品的制备与镜检  35-36
    3.2.2 透射电镜样品的制备与镜检  36
  3.3 结果与分析  36-39
    3.3.1 叶片色度比较  36-37
    3.3.2 叶片解剖结构显微及超显微观察  37-39
  3.4 小结  39-41
第四章原叶绿素酸酯氧还酶（POR）基因克隆及序列分析  41-50
  4.1 材料与方法  41-44
    4.1.1 植物材料  41
    4.1.2 菌株和质粒载体  41
    4.1.3 引物设计  41
    4.1.4 叶片中 RNA 提取  41-42
    4.1.5 cDNA 第一条链的合成  42
    4.1.6 叶片基因组 DNA 提取  42-43
    4.1.7 目的基因 cDNA 序列扩增体系与反应条件  43
    4.1.8 目的基因基因组序列扩增体系与反应条件  43-44
  4.2 结果与分析  44-49
    4.2.1 基因编码区序列克隆  44-45
    4.2.2 POR 系统进化树分析  45-46
    4.2.3 基因组序列的获得  46-49
  4.3 小结  49-50
第五章 HTPOR 体外表达、活性鉴定及 WESTERN BLOTTING  50-60
  5.1 材料与方法  50-53
    5.1.1 主要试剂  50
    5.1.2 POR 成熟蛋白编码区序列的扩增  50
    5.1.3 原核表达载体构建  50
    5.1.4 原核表达载体转化重组表达菌株  50-51
    5.1.5 重组蛋白诱导表达和纯化  51
    5.1.6 原叶绿素酸酯（Pchlide）提取  51-52
    5.1.7 MBP-POR 融合蛋白活性鉴定  52
    5.1.8 叶片总蛋白提取  52
    5.1.9 Western Blotting 分析  52-53
  5.2 结果与分析  53-58
    5.2.1 原核表达载体构建及表达菌株转化  53-55
    5.2.2 重组表达载体体外诱导表达及融合蛋白纯化  55-56
    5.2.3 重组蛋白体外活性鉴定  56-57
    5.2.4 Western blotting 结果分析  57-58
  5.4 小结  58-60
第六章结论与讨论  60-67
  6.1 结论  60-61
  6.2 讨论  61-65
    6.2.1 色素组成对叶片颜色的影响  61-62
    6.2.2 花叶竹叶片的色度和结构特征  62-63
    6.2.3 原叶绿素酸酯还原酶基因的克隆和分析  63-64
    6.2.4 原叶绿素酸酯还原酶的原核表达及功能鉴定  64-65
  6.3 展望  65-67
参考文献  67-75
附录  75-76
在读期间学术研究  76-77
致谢  77-78
摘要  78-79

4种观赏竹花叶色素组成、结构分析及相关调控基因的研究

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