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抗旱候选基因单核苷酸多态性与牛枝子耐旱性研究

作　者: 李静
导　师: 李伟
学　校: 北京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 牛枝子 LpDREB基因 LpP5CS基因单核苷酸多态性生理指标
分类号: S793.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

牛枝子(Lespedeza potaninii)为豆科植物中最具耐旱特性的灌木树种之一,广泛分布于干旱、半干旱及草原荒漠地带,可作为研究基于单核苷酸多态性(SNP)水平的植物耐旱差异机制的材料。本研究以牛枝子为材料,研究了牛枝子LpDREB,LpP5CS基因组织表达及诱导表达规律,利用染色体步移及3’RACE技术克隆了LpDREB, LpP5CS基因,并进行了基因结构、系统进化、SNP分布及类型分析,同时对8个种源的300株牛枝子个体进行了生理生化指标的测量及分析。研究结果如下：1、牛枝子LpDREB基因cDNA序列长度为1611bp,具有957bp的开放阅读框,编码318个氨基酸,基因内部没有内含子：该基因同大豆GmDREB3基因的同源性最高；干旱胁迫诱导LpDREB基因在牛枝子的根、茎及叶中表达；本研究共检测到23个SNPs位点,其中有12个转换,11个颠换。编码区内的17个SNPs位点中,9个属于同义突变,8个为非同义突变。2、牛枝子LpP5CS基因DNA序列长度为6194bp,cDNA序列长度为2148bp,可编码716个氨基酸残基的蛋白质；该基因编码的氨基酸序列同大豆GmP5CS、四季豆PvP5CS等的氨基酸序列具有较高的同源性；LpP5CS基因在不同组织中的表达水平同对照组相比均有不同程度的改变；长度为6194bp的序列中共有SNPs位点176个,其中有113个转换,62个颠换,编码区内的43个SNPs位点中19个为同义突变,错义突变23个3、牛枝子8个种源脯氨酸含量,丙二醛含量及电导率的方差和分量分析显示,三个生理指标均有极显著差异,多重比较结果表明丙二醛含量及电导率的测定对于8个种源间多态性的分析更有意义。本研究为基于单核苷酸多态性的牛枝子抗旱机制的研究提供了重要的理论依据。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-6
本文缩略词(Abbreviation)  6-7
目录  7-10
1 引言  10-16
  1.1 单核苷酸多态性在分子育种中的应用  11-12
    1.1.1 单核苷酸多态性的意义  11
    1.1.2 单核苷酸多态性的检测方法  11-12
      1.1.2.1 PCR扩增目的序列及其产物测序法  11
      1.1.2.2 基因芯片法  11-12
      1.1.2.3 质谱法  12
    1.1.3 单核苷酸多态性在林木分子育种中的应用  12
  1.2 牛枝子抗旱候选基因的选择  12-14
    1.2.1 脯氨酸合成酶与植物抗旱性的关系  13
    1.2.2 DREB转录因子的研究进展  13-14
  1.3 牛枝子抗旱性研究进展  14-15
  1.4 本研究的主要内容及技术路线  15-16
2 牛枝子LPDREB,LPP5CS基因的克隆及序列分析  16-34
  2.1 实验材料及试剂  16
    2.1.1 实验材料与处理方法  16
    2.1.2 实验试剂  16
    2.1.3 主要仪器设备  16
  2.2 实验方法  16-22
    2.2.1 牛枝子LPDREB基因克降  16-20
      2.2.1.1 引物设计  16-17
      2.2.1.2 牛枝子基因组DNA的提取  17
      2.2.1.3 牛技子叶片总RNA的提取  17
      2.2.1.4 CDNA第一链的合成  17
      2.2.1.5 染色体步移文库的构建  17-19
      2.2.1.6 PCR扩增  19
      2.2.1.7 PCR产物的胶回收纯化  19
      2.2.1.8 纯化回收片段与载体连接  19
      2.2.1.9 质粒的转化和蓝白斑筛选  19
      2.2.1.10 测序和序列分析  19
      2.2.1.11 牛枝子干旱胁迫处理  19
      2.2.1.12 LPDREB基因组织及诱导表达  19-20
    2.2.2 牛枝子LPP5CS基因克隆  20-22
      2.2.2.1 引物设计  20-21
      2.2.2.2 染色体步移法扩增LPP5CS基因DNA片段序列  21
      2.2.2.3 3'RACE扩增LPP5CS基因CDNA片段序列  21
      2.2.2.4 牛枝子干旱胁迫处理  21-22
      2.2.2.5 LPP5CS基因组织及诱导表达  22
  2.3 结果与分析  22-31
    2.3.1 牛枝子LPDREB基因序列分析  22-27
      2.3.1.1 DNA酶切片段文库分析  22-23
      2.3.1.2 PCR扩增结果  23
      2.3.1.3 DNA序列分析  23-24
      2.3.1.4 LPDREB基因同源性及系统进化分析  24-26
      2.3.1.5 LPDREB基因组织及干旱胁迫诱导表达  26-27
    2.3.2 牛枝子LPP5CS基因序列分析  27-31
      2.3.2.1 PCR扩增结果分析  27-28
      2.3.2.2 DNA序列分析  28
      2.3.2.3 LPP5CS基因同源性及系统进化分析  28-30
      2.3.2.4 LPP5CS基因组织及干旱胁迫诱导表达  30-31
  2.4 小结  31-34
3 牛枝子LPDREB,LPP5CS基因单核苷酸多态性分析  34-42
  3.1 实验材料及试剂  34
    3.1.1 实验材料与处理方法  34
    3.1.2 实验试剂  34
    3.1.3 主要仪器设备  34
  3.2 实验方法  34-36
    3.2.1 LPDREB,LPP5CS基因的SNP位点的筛选  34-36
      3.2.1.1 PCR引物设计  34-36
      3.2.1.2 DNA的提取  36
      3.2.1.3 PCR扩增  36
      3.2.1.4 PCR产物与载体连接  36
      3.2.1.5 DNA序列测序及SNPs位点的检测  36
  3.3 结果与分析  36-40
    3.3.1 LPDREB基因的SNPs分析  36-38
      3.3.1.1 SNPs数量、变异类型及频率的分析  36-37
      3.3.1.2 SNPs引起的氨基酸变异类型分析  37-38
    3.3.2 LPP5CS基因的SNPs分析  38-40
      3.3.2.1 SNPs数量、变异类型及频率的分析  38
      3.3.2.2 SNPs引起的氨基酸变异类型分析  38-40
  3.4 小结  40-42
4 牛枝子耐旱生理指标的测定及分析  42-50
  4.1 实验材料及试剂  42
    4.1.1 实验材料与处理方法  42
    4.1.2 实验试剂  42
    4.1.3 主要仪器设备  42
  4.2 实验方法  42-44
    4.2.1 茚三酮法测定牛枝子游离脯氨酸含量  42-44
    4.2.2 三氯乙酸法测定牛枝子叶片丙二醛醛含量  44
    4.2.3 电导仪法测定牛枝子叶片电导率  44
  4.3 结果与分析  44-47
    4.3.1 牛枝子个体间耐旱性差异分析  44-46
    4.3.2 牛枝子种源间耐旱性差异分析  46
    4.3.3 牛枝子种源间耐旱性差异多重比较  46-47
  4.4 小结  47-50
5 讨论  50-54
  5.1 抗旱候选基因克隆及SNPs分析  50-52
    5.1.1 LPDREB基因结构与SNPs分析  50-51
    5.1.2 LPP5CS基因结构与SNPs分析  51-52
  5.2 牛枝子干旱胁迫处理后生理指标变化  52-54
6 结论  54-56
参考文献  56-60
附录  60-61
个人简介  61-62
导师简介  62-63
致谢  63

抗旱候选基因单核苷酸多态性与牛枝子耐旱性研究

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