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小麦幼胚农杆菌转化体系优化

作 者: 武海娜
导 师: 温树敏; 刘桂茹
学 校: 河北农业大学
专 业: 植物资源学
关键词: 小麦 幼胚 组织培养 EeAP2-1.1 OsDREB2.2 农杆菌介导
分类号: S512.1
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要


小麦幼胚培养能力高、植株再生能力强,被认为是转基因最理想的外植体材料,利用农杆菌介导法进行小麦幼胚遗传转化研究有助于推动小麦基因工程育种的进程。本研究以不同小麦基因型的幼胚为受体材料,通过筛选高培养力基因型,改良诱导培养基和愈伤分化再生等途径,优化了小麦幼胚组织培养高频再生体系。在此基础上采用农杆菌介导的方法对小麦幼胚愈伤组织进行EeAP2-1.1、OsDREB2.2等抗逆转录因子的遗传转化,并对影响遗传转化效率的因素进行了研究,优化了农杆菌介导的小麦幼胚遗传转化体系。获得的主要研究结果如下:1.通过对不同基因型小麦材料进行幼胚愈伤组织诱导及分化再生试验,明确了小麦的胚龄、基因型、幼胚愈伤诱导培养基、生长素和细胞分裂素是影响小麦幼胚愈伤组织形成和分化再生的重要因素,确定了在保定地区河农827等4个冬小麦品种幼胚的最佳培养时期为胚龄1216 d;NO.1ˊ、DIC、W1、W2四种改良培养基诱导愈伤效果较好;最佳分化培养基激素配比:1.0 mg/L KT+0.2-0.4 mg/L NAA;筛选出4个适合小麦幼胚培养和植株再生的基因型材料,初步优化了小麦幼胚愈伤组织再生体系。2.对14个小麦基因型进行农杆菌敏感性检测分析,组织化学染色结果表明,河农827的愈伤对农杆菌侵染比较敏感,GUS基因瞬时表达率达91.91%。利用混合正交设计L8(41×24)对河农827进行遗传转化研究,得到最佳转化条件为愈伤组织在诱导培养基W2上诱导培养6 d,农杆菌OD660=1时进行侵染3 h。明确了筛选体系中抗生素的适宜添加浓度为25 mg/L G418+250 mg/L carb;用含有抗生素的PCM液体培养基洗涤共培养后的愈伤,能够减小对愈伤造成的损伤,获得较多的抗性愈伤;采用22℃条件下滤纸上培养3 d的共培养方式以及农杆菌侵染液中加入0.01%的表面活性剂聚醚F68,能够减小愈伤褐化率,有助于提高小麦愈伤组织的转化效率;在生根培养基上添加1mg/L IBA,解决了农杆菌侵染后再生苗不易生根的难题,初步优化了农杆菌介导的小麦幼胚遗传转化体系。3.利用优化的小麦幼胚遗传转化体系将EeAP2-1.1、OsDREB2.2抗逆转录因子转入小麦幼胚愈伤组织中,获得了47株T0抗性再生植株,经PCR初步鉴定筛选出7株阳性转基因植株。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
1 引言  10-22
  1.1 植物抗旱基因工程研究进展  10-11
    1.1.1 植物抗旱改良基因  10
    1.1.2 DREB 转录因子在植物抗旱中的作用  10-11
  1.2 小麦遗传转化的主要方法  11-14
    1.2.1 基因枪法  11-12
    1.2.2 农杆菌介导法  12
    1.2.3 花粉管通道法  12-13
    1.2.4 其他转化方法  13-14
  1.3 小麦农杆菌转化研究现状  14-20
    1.3.1 小麦不同外植体农杆菌转化进展  14-17
    1.3.2 影响农杆菌法转化小麦幼胚的因素  17-19
    1.3.3 农杆菌转化小麦幼胚存在的主要问题  19-20
  1.4 本研究的内容和意义  20-22
2 材料和方法  22-28
  2.1 试验材料  22-23
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 外源基因、质粒载体及其农杆菌菌系  22
    2.1.3 试剂及耗材  22
    2.1.4 仪器设备  22
    2.1.5 数据计算及统计分析  22-23
  2.2 试验方法  23-28
    2.2.1 小麦幼胚培养和农杆菌转化方法  23-25
    2.2.2 组织化学染色检测  25
    2.2.3 小麦抗性再生植株DNA 提取及PCR 检测  25-28
3 结果与分析  28-45
  3.1 小麦幼胚植株再生体系的优化  28-35
    3.1.1 胚龄对愈伤组织的诱导效果  28-30
    3.1.2 不同基因型小麦幼胚出愈率和植株再生能力的差异  30-31
    3.1.3 愈伤组织诱导培养基的优化改良  31-34
    3.1.4 筛选的3 种不同培养基对小麦胚性愈伤组织及再生率的影响  34-35
    3.1.5 细胞分裂素和生长素对小麦幼胚愈伤组织分化的影响  35
  3.2 小麦幼胚遗传转化体系的优化  35-43
    3.2.1 小麦基因型农杆菌敏感性检测分析  35-37
    3.2.2 不同抗生素浓度对愈伤组织分化的影响  37-38
    3.2.3 多因素组合对转化效率的影响  38-40
    3.2.4 洗涤方式对抗性愈伤形成与分化的影响  40-41
    3.2.5 共培养温度和时间  41-42
    3.2.6 表面活性剂对转化的影响  42
    3.2.7 生根的研究  42-43
  3.3 抗性再生植株的获得及PCR 检测  43-45
4 讨论  45-50
  4.1 关于小麦幼胚组织培养特性  45-46
    4.1.1 小麦幼胚胚龄  45
    4.1.2 基因型与植株再生能力  45-46
    4.1.3 愈伤组织诱导培养基  46
  4.2 关于小麦幼胚遗传转化体系  46-50
    4.2.1 遗传转化方案  46-47
    4.2.2 高渗预处理及表面活性剂的辅助处理  47-48
    4.2.3 抗生素筛选  48
    4.2.4 愈伤生长停滞及生根困难  48-50
5 结论  50-51
参考文献  51-57
作者简历  57-58
在读期间发表论文  58-59
致谢  59-60

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > > 小麦
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