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高温对抗性和敏感小菜蛾caspase基因和hsp70基因热激表达及抗性进化的影响

作　者: 庄华梅
导　师: 吴刚
学　校: 福建农林大学
专　业: 农药学
关键词: 小菜蛾 热胁迫 caspase hsp70 抗药性
分类号: S433.4
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


小菜蛾是世界性十字花科蔬菜的重大害虫,根据本实验前人研究结果,高温下抗性和敏感小菜蛾生理适合度显著降低,本文选择了高温下显著上调表达的两个基因——caspase和hsp70作为生理适合度指标,通过生化、分子生物学及抗药性测定技术进行了高温对抗性和敏感小菜蛾caspase和hsp70基因热激表达及抗性水平的比较研究。研究揭示了高温条件下小菜蛾种群抗药性水平急剧下降,且这种抗性水平的下降是可遗传的。caspase是细胞凋亡过程中的关键酶,起到执行细胞凋亡的功能,本文通过同源克隆的策略和RACE技术,克隆得到一个1172bp长的小菜蛾caspase基因(Px-caspase-1),具有完整的开放阅读框,开放阅读框长903bp,编码具有300个氨基酸的caspase蛋白,分子量为33.6kDa。与其它昆虫caspase基因的氨基酸序列比对结果显示,Px-caspase-1)属于效应caspase。高温(32.1、36、40、42、45、47℃)和常温(25℃)预处理对caspase-9(起始caspase)和caspase-3(效应caspase)的酶活力及1px-caspase-1mRNA表达量变化影响的研究结果表明,常温下小菜蛾成虫体内存在caspase-9和caspase-3的酶活性及Px-caspase-1基因表达,高温能够显著诱导caspase-9和caspase-3酶活力增高以及Px-caspase-1mRNA表达上调,且随着温度的升高上调表达的高峰提前出现。此外,高温可导致小菜蛾成虫的死亡率显著增高。上述结果表明,常温25-C下细胞凋亡是小菜蛾的一种正常生命现象,而高温能够显著诱导小菜蛾发生细胞凋亡,使得细胞凋亡基因Px-caspase-1的上调表达高峰提前出现,加速小菜蛾的死亡。比较高温(32.1、40、42℃)处理不同时间敏感和抗性小菜蛾Px-caspase-1基因表达的差异,结果表明抗性小菜蛾Px-caspase-1基因在高温下的热激上调表达显著大于敏感小菜蛾。在热胁迫下的细胞凋亡与热休克蛋白70家族相关,本文克隆得到小菜蛾hsp70基因(Px-hsp70)序列的全长cDNA。该基因的cDNA序列长2128bp,具有5’非翻译区90bp,3’非翻译区140bp,开放阅读框为1899bp,演绎的蛋白质序列为632aa,分子量为69.3kDa。通过在NCBI上进行的序列比对及功能位点分析,Px-hsp70)禹于hsp70家族成员。通过采用雌、雄幼虫和雌、雄成虫为材料,25、37、42-C预处理3h后,无论在敏感还是抗性种群中整体上,幼虫的Px-hsp70表达量均比成虫Px-hsp70的表达量低,且高温诱导后幼虫Px-hsp70的表达量均无显著变化。在成虫中,高温可显著诱导敏感及抗性小菜蛾Px-hsp70的上调表达,但是高温对敏感小菜蛾Px-hsp70的上调表达程度显著大于对抗性小菜蛾的影响。这些结果表明,高温可显著抑制敏感和抗性小菜蛾的生理适合度,但是对抗性小菜蛾适合度的抑制作用更为显著。高温可显著影响小菜蛾的抗药性水平。田间监测的结果表明,夏季7月高温期间小菜蛾抗药性水平急剧下降。小菜蛾在高温下(33.5℃)饲养一代后对阿维菌素抗性水平大幅下降,高温饲养一代后小菜蛾抗药性水平急剧下降可能与高温下抗性小菜蛾适合度显著低于敏感小菜蛾有关。

全文目录


摘要  8-10
Abstract  10-14
第一章 文献综述  14-32
  1 CASPASE研究进展  14-25
    1.1 细胞凋亡概念  14
    1.2 caspase的特征与分类  14-16
    1.3 caspases的激活机制  16-17
    1.4 caspases的级联反应途径  17-19
    1.5 caspase的调控  19-20
    1.6 caspase家族成员研究进展  20-23
    1.7 昆虫caspase研究概况  23-25
      1.7.1 昆虫caspase特征与分类  23-24
      1.7.2 昆虫caspase的调控  24-25
      1.7.3 昆虫与哺乳动物细胞凋亡途径比较  25
  2 温度对细胞凋亡的影响  25-26
  3 热休克蛋白(HSP)研究概况  26-29
    3.1 HSP70基因特征与分类  27
    3.2 HSP70基因调控  27-28
    3.3 HSP70的生物学功能  28
    3.4 昆虫HSP70概况  28-29
  4 小菜蛾抗药性研究进展  29-30
    4.1 小菜蛾抗药性研究现状  29-30
    4.2 温度对小菜蛾抗药性的影响  30
  5 本研究的目的意义  30-32
第二章 小菜蛾PX-CASPASE-1基因克隆及热激表达研究  32-71
  1 材料与方法  32-47
    1.1 实验材料  32-34
      1.1.1 供试虫源  32
      1.1.2 高温对成虫的预处理  32-33
      1.1.3 生化试剂  33
      1.1.4 主要仪器设备  33-34
    1.2 药品配制  34
    1.3 Px-caspase-1基因中间片段克隆  34-39
      1.3.1 引物设计  34-35
      1.3.2 提取总RNA  35-36
      1.3.3 中间片段克隆  36-39
    1.4 RACE  39-42
      1.4.1 设计RACE引物  39-40
      1.4.2 cDNA第一链合成  40-41
      1.4.3 巢式PCR  41-42
    1.5 扩增Px-caspase-1基因ORF及序列分析  42
    1.6 Px-caspase-1 m RNA表达量测定  42-45
      1.6.1 荧光定量引物设计  43-44
      1.6.2 制作内参基因与目的基因标准曲线  44-45
      1.6.3 不同温度处理抗性小菜蛾Px-caspase-1mRNA表达量差异的测定  45
      1.6.4 抗、感小菜蛾Px-caspase-1mRNA表达量差异的测定  45
    1.7 起始caspase-9和效应caspase-3蛋白酶活力测定  45-47
      1.7.1 制作蛋白质标准曲线  45-46
      1.7.2 制作pNA标准曲线  46
      1.7.3 不同高温处理时caspase-9和caspase-3酶活力测定  46-47
    1.8 数据处理  47
  2 结果与分析  47-66
    2.1 高温对成虫的预处理  47-48
    2.2 Px-caspase-1基因克隆及序列分析  48-56
      2.2.1 Px-caspase-1中间片段的克隆  48-49
      2.2.2 Px-caspase-1基因RACE  49-51
      2.2.3 Px-caspase-1ORF的克隆  51-53
      2.2.4 Px-caspase-1基因序列分析  53-56
    2.3 小菜蛾Px-caspase-1基因表达  56-60
      2.3.1 制作内参基因与目的基因标准曲线  56-57
      2.3.2 不同温度处理抗性小菜蛾Px-caspase-1mRNA表达量差异的测定  57-59
      2.3.3 抗、感小菜蛾Px-caspase-1 mRNA表达量差异测定  59-60
    2.4 起始caspase-9和效应caspase-3酶活力测定  60-66
      2.4.1 蛋白质浓度标准曲线  60-61
      2.4.2 pNA标准曲线  61
      2.4.3 不同高温处理时caspase-9和caspase-3酶活力测定  61-66
  3 讨论  66-70
    3.1 Px-caspase-1基因克隆  66-67
    3.2 高温的选择  67
    3.3 不同高温对Px-caspase-1 mRNA表达的影响  67-69
    3.4 不同高温对caspase-9和caspase-3酶活力的影响  69-70
  4 结论  70-71
第三章 小菜蛾PX-HSP70基因克隆及热激表达研究  71-83
  1 材料与方法  71-73
    1.1 虫源及温度预处理方法  71
    1.2 药品试剂仪器  71
    1.3 克隆Px-hsp70基因  71-73
      1.3.1 设计RACE引物  71-72
      1.3.2 RACE  72
      1.3.3 Px-hsp70全长序列分析  72-73
    1.4 Px-hsp70 mRNA表达量测定  73
      1.4.1 设计qPCR引物  73
      1.4.2 抗、感小菜蛾幼虫及成虫的Px-hsp70表达量比较  73
    1.5 数据处理  73
  2 结果与分析  73-81
    2.1 Px-hsp70 RACE  73-75
    2.2 Px-hsp70全长序列分析  75-79
    2.3 抗、感小菜蛾幼虫及成虫的Px-hsp70 mRNA表达量比较  79-81
      2.3.1 内参基因与目的基因标准曲线  79
      2.3.2 抗、感小菜蛾幼虫及成虫的Px-hsp70 mRNA表达  79-81
  3 讨论  81
    3.1 Px-hsp70基因克隆  81
    3.2 抗、感小菜蛾Px-hsp70 mRNA的热激表达差异  81
  4 结论  81-83
第四章 温度对小菜蛾抗药性水平的影响  83-88
  1 材料与方法  83-84
    1.1 供试虫源  83
    1.2 生物测定  83-84
    1.3 温度对小菜蛾后代抗性水平变化的影响  84
    1.4 数据处理  84
  2 结果与分析  84-85
    2.1 小菜蛾抗药性临测  84
    2.2 温度对小菜蛾后代抗性水平变化的影响  84-85
  3 讨论  85-86
  4 结论  86-88
存在问题与展望  88-89
参考文献  89-100
致谢  100-101
在读期间发表的文章及参与的课题  101

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物虫害及其防治 > 鳞翅目害虫
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