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胡萝卜与黄粉虫抗冻蛋白基因融合在拟南芥中的表达与抗冻性分析

作　者: 张振华
导　师: 陈介南；王义强
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 植物抗寒性植物抗冻性胡萝卜抗冻蛋白黄粉虫抗冻蛋白基因融合拟南芥
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物在遭遇冻害时,细胞内环境脱水、结晶,从而造成细胞物理性损害或死亡。而植物要抵抗冻害,需要具备两个最基本的要素：一是避免细胞内结冰；二是提高细胞膜结构及核酸蛋白质等生命物质的低温稳定性。而细胞外结冰和细胞液的过冷却则是植物避免细胞内结冰伤害的最主要和最普遍的两种适应机制。抗冻蛋白(antifreeze protein,AFP)是一种具有阻止体液内冰核形成与生长、维持体液非冰冻状态的高效抗冻物质,最早是由美国加利福尼亚大学的DeVries在20世纪60年代从极区海鱼的血清中发现的,能够有效地提高植物的抗冻性。本研究以胡萝卜和黄粉虫为材料,依据NCBI登录号号AJ131340和AF 159114基因序列分别设计特异引物,采用RT-PCR方法克隆到胡萝卜抗冻蛋白基因(DcAFP)和黄粉虫抗冻蛋白基因(TmAFP)cDNA全序列。通过重叠延伸PCR,将两个基因前后串联起来构建成融合基因Dc-TmAFP和Tm-DcAFP,并构建了植物表达载体,通过农杆菌介导转化模式植物拟南芥,并成功获得四个基因的转基因拟南芥。四个外源目的基因在转基因植株中的转录量经Real-time PCR试验分析,同野生型相比都得到了超量表达,证明4个基因已成功转入拟南芥中。本研究对转基因拟南芥进行抗冻实验处理,并进行了存活率统计和叶片黄花率统计分析。存活率分析结果表明野生型植株同转DcAFP. TmAFP.Dc-TmAFP和Tm-DcAFP基因植株存在显著差异；Tm-DcAFP亦同DcAFP.TmAFP.Dc-TmAFP基因植株存在显著差异。其中以转DcAFP基因的植株存活率最高,为86.387%；转TmAFP.Dc-TmAFP Tm-DcAFP基因的植株平均存活率分别为86.079%、85.923%和78.993%；野生型植株存活率为0。依据存活率统计排列各基因型耐冻性从高到低顺序为：DcAFP & TmAFP & Dc-TmAFP>Tm-DcAFP>WT.叶片黄花率分析结果表明：转TmAFP基因同转DcAFP.Dc-TmAFP和Tm-DcAFP基因植株存在显著差异；转Dc-TmAFP基因同DcAFP和Tm—DcAFP基因植株亦存在明显差异；转DcAFP和Tm-DcAFP基因植株之间无明显差异。其中,以转TmAFP基因存活植株叶片黄化的黄花率最低,为41.966%；转Dc-TmAFP基因存活植株叶片黄化的黄花率最高,为86,369%；转DcAFP基因和Tm-DcAFP基因存活植株叶片黄化的黄花率分别为57.97%和54.622%。依据存活植株叶片黄花率统计排列各基因型抗冻性从高到低顺序为：TmAFP> Tm-DcAFP & DcAFP> Dc-TmAFP。通过存活率和叶片黄花率统计分析结果表明,不同功能的抗冻蛋白对植物的抗冻性有不同的帮助,热滞效应高效的TmAFP对植物降低冰点方面效果大,而在植物遭受较长时间冻害时,抑制重结晶效应高效的DcAFP对植物非原生质中流体保持稳定性作用较大,从而提高植物的耐冻能力。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章绪言  11-21
  引言  11
  1.1 脂肪酸去饱和酶的研究  11-13
    1.1.1 脂肪酸去饱和酶种类  12
    1.1.2 脂肪酸去饱和酶作用机制  12-13
  1.2 抗冻蛋白的作用机理  13-18
    1.2.1 抗冻蛋白的高级结构模型  13-16
    1.2.2 抗冻蛋白作用机理  16-17
    1.2.3 增强剂对抗冻蛋白活性的影响  17-18
  1.3 植物转抗冻蛋白基因研究  18-19
  1.4 研究目标和主要研究内容  19-20
    1.4.1 研究目标与意义  19
    1.4.2 主要研究内容  19-20
  1.5 本研究技术路线  20-21
第二章材料与方法  21-39
  2.1 引言  21
  2.2 胡萝卜抗冻蛋白(DCAFP)基因与黄粉虫抗冻蛋白(TMAFP)基因克隆  21-29
    2.2.1 试验材料及其来源  22-23
    2.2.2 胡萝卜(Daucus carota)与黄粉虫(Tentbrio molitor)幼虫RNA提取  23-24
    2.2.3 DcAFP基因与TmAFP基因cDNA第一链的合成  24-25
    2.2.4 DcAFP全长cDNA编码序列的分子克隆  25-26
    2.2.5 TmAFP全长cDNA编码序列的分子克隆  26
    2.2.6 DcAFP基因与TmAFP基因RT-PCR扩增产物的回收  26-27
    2.2.7 DcAFP基因与TmAFP基因回收产物与pMD18-T Simple载体连接  27
    2.2.8 连接反应产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a  27-28
    2.2.9 阳性克隆的质粒提取与酶切验证  28-29
  2.3 DCAFP基因与TMAFP基因的融合基因克隆  29-31
    2.3.1 融合基因中间模板克隆  29-30
    2.3.2 融合基因PCR扩增  30
    2.3.3 融合基因的PCR扩增产物回收  30
    2.3.4 融合基因回收产物与pMD18-T Simple载体连接  30
    2.3.5 连接反应产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α  30-31
    2.3.6 阳性克隆的质粒酶切验证  31
  2.4 植物超量表达载体的构建  31-32
    2.4.1 pBI121大片段回收  31-32
    2.4.2 目的基因小片段回收  32
    2.4.3 目的基因小片度连接pBI121大片段  32
    2.4.4 连接反应产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α  32
    2.4.5 阳性克隆的质粒酶切验证  32
  2.5 表达载体转化农杆菌  32-33
    2.5.1 CaCL2法制备农杆菌感受态细胞  32-33
    2.5.2 电击转化农杆菌GV3101  33
  2.6 农杆菌介导的花序侵染法转化拟南芥  33-34
    2.6.1 野生型拟南芥的培养  33
    2.6.2 菌液的制备及转化拟南芥(花序侵染法)  33-34
    2.6.3 阳性植株的筛选  34
  2.7 转基因植株的PCR筛选  34-36
    2.7.1 CTAB法植物DNA的快速微量提取  34-35
    2.7.2 PCR扩增  35-36
  2.8 REALTIME PCR检测转基因植株转录表达量  36-37
    2.8.1 Real-time PCR模板制备  36
    2.8.2 Real-time PCR引物设计  36-37
    2.8.3 Real-time PCR反应  37
  2.9 转基因植株萌芽期-10℃低温试验分析  37-39
第三章结果与分析  39-57
  3.1 胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)与黄粉虫抗冻蛋白(TMAFP)基因克隆  39-40
    3.1.1 胡萝卜(Daucus carota)与黄粉虫(Tentbrio molitor)幼节虫总RNA提取  39
    3.1.2 胡萝卜抗冻蛋白(DcAFP)基因cDNA克隆  39-40
    3.1.3 黄粉虫抗冻蛋白(TmAFP)基因cDNA克隆  40
  3.2 DcAFP基因与TMAFP基因的融合基因克隆  40-42
    3.2.1 中间模板的克隆  41
    3.2.2 融合基因的PCR扩增  41-42
  3.3 植物超量表达载体酶切鉴定  42-43
  3.4 转基因拟南芥筛选及基因组PCR鉴定  43-46
    3.4.1 转基因拟南芥T0代筛选  43
    3.4.2 T0代阳性植株基因组PCR鉴定  43-46
  3.5 转基因拟南芥REAL-TIME PCR表达量分析  46-47
  3.6 转基因植株萌芽期-10℃低温处理实验  47-57
    3.6.1 低温冻害后存活统计分析  47-51
    3.6.2 低温冻害后有叶片黄化的转基因植株黄花率统计分析  51-57
第四章结论与讨论  57-61
  4.1 DCAFP、TMAFP、Dc-TMAFP和TM-DcAFP基因cDNA全长克隆  57-58
  4.2 DCAFP、TMAFP、Dc-TMAFP和TM-DcAFP基因在转基因拟南芥中超量表达  58
  4.3 抗冻蛋白基因与拟南芥抗冻性相关  58-59
  4.4 创新点  59
  4.5 建议  59-61
参考文献  61-68
附录A:缩略词表  68-69
附录B:攻读学位期间的主要学术成果  69-70
致谢  70

胡萝卜与黄粉虫抗冻蛋白基因融合在拟南芥中的表达与抗冻性分析

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