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糖核苷酸的酶法合成与唾液酸糖肽的分离制备

作　者: 邹洋
导　师: 陈敏
学　校: 山东大学
专　业: 生物工程
关键词: 糖-1-磷酸糖核苷酸半乳糖激酶 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶酶法合成唾液酸糖肽分离制备
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

糖类(包括单糖、寡糖和多糖)和糖缀合物广泛存在于生物体内,作为重要的结构组分和信息分子,在许多生物学过程中都发挥着重要的作用。糖链的结构与其功能有着密切的联系,有些糖链的改变会引起特定的生理反应,因此,糖链的结构与功能研究是糖生物学和生物医药领域的关注热点。本论文主要分为两个主要部分：一是合成多种糖核苷酸(第二章和第三章),作为糖基转移酶合成糖缀合物的糖基供体；二是分离制备唾液酸糖肽,作为内切糖苷酶合成糖缀合物的糖基供体。在糖核苷酸的体外合成中,最为简便的方法是利用补救途径中的糖激酶和焦磷酸化酶进行合成。单糖首先在糖激酶的催化下合成糖-1-P,再利用焦磷酸化酶合成相应的糖核苷酸。因此,糖-1-P的合成是糖核苷酸合成的第一步。本论文的目标之一是解决酶法合成Gal/Glc-1-P及其结构类似物的问题,进而实现UDP-Gal/Glc及其结构类似物的酶法合成。本文第二章首先对肺炎链球菌来源的半乳糖激酶(GalKSpe4)进行了体外的表达及纯化,然后,我们选用了34种单糖(包括Gal/Glc及其结构类似物和6种L型糖)与半乳糖激酶进行反应,并对产物和产率进行了检测。半乳糖激酶具有较宽的底物适应性,它能够利用34种单糖中的14种作为底物,对于C-2、C-4、C-6位的变化都有较强的适应性,但是其催化活性会随着C-2位空间位阻的变大而逐渐降低,并且若在半乳糖结构中有两个位置同时变化,GalKSpe4则无法利用。另外,D型和L型对于GalKSpe4的识别也是十分重要。相比之前报道过的半乳糖激酶,它可以较为高效的合成Glc-1-P(25%)、GalNAc-1-P(68%),同时还具备合成从未报道过的L-Man-1-P(43%)的能力,这也是对半乳糖激酶研究的一个重大发现。同时,我们对几种糖-1-P进行了大量合成,并对其进行了纯化和结构鉴定,建立了一套完整的合成-纯化-鉴定糖-1-P的制备体系。本文第三章在第二章研究的基础上,又对大肠杆菌来源的UDP-Glc焦磷酸化酶进行了表达和纯化,然后以第二章中半乳糖激酶能够利用的单糖为底物,利用半乳糖激酶和UDP-Glc焦磷酸化酶,一锅法合成各种糖核苷酸,并对产物的结构和产率进行了测定。实验结果表明,在14种单糖中,其中9种单糖可以通过一锅法直接合成相应的糖核苷酸。对于C-2位发生结构修饰的Gal结构类似物,只有Gal-2-N3的利用率达到了78%,Ga1NAc的利用率有32%,而Gal-2-DeO的利用率仅有15%,对于C-2位有较大取代基的Gal的结构类似物,没有转化成相应的糖核苷酸。对于C-4位、C-6位发生结构修饰的Gal结构类似物来说,随着空间位阻的变大,转化率有所降低。同时,我们利用一锅法大量合成了UDP-Glc并对产物进行了纯化和鉴定,建立了一套完整的糖核苷酸制备体系。利用糖苷内切酶的转糖基活性来合成带有均一糖链的糖蛋白和糖肽是目前较为高效的合成策略,特别是对于一些带有完整N-糖链的糖蛋白的合成。利用这种方法合成带有完整糖链的糖蛋白必须要有完整均一的糖链作为糖基供体。唾液酸糖肽是一种带有完整唾液酸化的N-糖量的糖肽,目前作为糖苷酶切酶的糖基供体已经广泛的用于糖蛋白的合成过程中。本文第四章的目标就是探索一种更为高效简便、周期短、成本低的唾液酸糖肽的分离制备方法。在本章中,我们用活性炭柱取代阴阳离子交换柱进行分离纯化,取代葡聚糖凝胶G-25进行脱盐,将原有的七个主要分离纯化步骤,简化为三个,并对分离纯化的条件进行了优化。通过实验,我们从100个鸡蛋卵黄中纯化出唾液酸糖肽680mg,并其进行了结构鉴定和纯度测定,经检测,该唾液酸糖肽的结构与文献报道致,且HPLC纯度可达95%以上。我们建立了一套步骤简、周期短、成本低的唾液酸糖肽的制备体系,对糖生物学领域和生物医药领域都具有十分重要的意义。

全文目录

中文摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
符号说明  15-19
第一章绪论  19-38
  1.1 糖类化合物的合成  20-26
    1.1.1 糖类结构的多样性  20
    1.1.2 寡糖的合成与制备  20-21
    1.1.3 糖核苷酸的种类及生物学功能  21-22
    1.1.4 糖核苷酸的生物合成途径  22-24
    1.1.5 糖-1-P的酶法合成  24-25
    1.1.6 糖核苷酸的合成及制备  25
    1.1.7 糖核苷酸的应用  25-26
  1.2 糖蛋白及其糖链  26-38
    1.2.1 糖蛋白的结构  26-27
    1.2.2 糖蛋白及其糖链的生物学功能  27
    1.2.3 糖蛋白和糖肽的体内合成途径  27-28
    1.2.4 均一化糖蛋白的合成策略  28-30
    1.2.5 内切糖苷酶法合成均一化糖蛋白研究进展  30-34
    1.2.6 唾液酸糖肽的研究进展  34-36
    1.2.7 唾液酸糖肽在糖苷内切酶法中的应用  36-38
第二章葡萄糖-1-P和半乳糖-1-P及其结构类似物的化学酶法合成  38-57
  2.1 引言  38-39
  2.2 实验材料  39-43
    2.2.1 菌株和载体  39
    2.2.2 试剂和耗材  39-40
    2.2.3 培养基与溶液  40-42
    2.2.4 主要仪器  42-43
  2.3 实验方法  43-48
    2.3.1 半乳糖激酶重组质粒的转化及酶的表达和纯化  43-45
    2.3.2 半乳糖激酶的检测  45-46
    2.3.3 各种单糖-1-P的合成  46
    2.3.4 糖-1-P产物的定性与定量测定  46-47
    2.3.5 糖-1-P的大量合成  47
    2.3.6 硅胶柱纯化糖-1-P  47-48
    2.3.7 糖-1-P的结构鉴定  48
  2.4 结果与讨论  48-56
    2.4.1 半乳糖激酶蛋白表达和纯化  48-49
    2.4.2 半乳糖激酶酶活检测  49
    2.4.3 各种糖-1-P的合成及定性检测  49-50
    2.4.4 DNS法定量测定各种糖-1-P的产率  50-54
    2.4.5 几种糖-1-P的大量合成及纯化  54-56
  2.5 本章小结  56-57
第三章一锅法合成UDP-Glc/Gal及其结构类似物  57-71
  3.1 引言  57-58
  3.2 实验材料  58-59
    3.2.1 菌株和载体  58
    3.2.2 酶、试剂和耗材  58
    3.2.3 培养基和缓冲液  58
    3.2.4 主要仪器  58-59
  3.3 实验方法  59-63
    3.3.1 GalU重组质粒的转化和蛋白的表达与纯化  59
    3.3.2 GalU的检测  59-61
    3.3.3 一锅法合成UDP-Gal和UDP-Glc  61
    3.3.4 一锅法合成糖核苷酸的条件摸索  61-62
    3.3.5 一锅法合成各种糖核苷酸  62
    3.3.6 糖核苷酸的大量合成  62
    3.3.7 分子筛P-2分离纯化糖核苷酸  62-63
  3.4 结果与讨论  63-70
    3.4.1 GalU的蛋白表达和纯化  63
    3.4.2 GalU酶活检测  63-64
    3.4.3 一锅法合成UDP-Gal和UDP-Glc  64-65
    3.4.4 One-Pot反应条件优化  65-67
    3.4.5 一锅法合成多种糖核苷酸  67-70
    3.4.6 几种糖核苷酸的大量合成和纯化  70
  3.5 本章小结  70-71
第四章唾液酸糖肽的分离制备  71-83
  4.1 引言  71-73
  4.2 实验材料及仪器  73
    4.2.1 实验材料  73
    4.2.2 实验仪器  73
  4.3 实验方法  73-76
    4.3.1 鸡蛋卵黄预处理  73-74
    4.3.2 葡聚糖凝胶G-50分离  74
    4.3.3 G-50洗脱液检测及收集  74-75
    4.3.4 活性炭脱盐纯化  75
    4.3.5 SGP的结构测定  75-76
    4.3.6 反向HPLC检测SGP纯度  76
  4.4 结果与讨论  76-82
    4.4.1 从鸡蛋卵黄中分离SGP  76-78
    4.4.2 SGP结构分析  78-81
    4.4.3 SGP纯度测定  81-82
  4.5 本章小结  82-83
全文总结  83-85
参考文献  85-94
攻读学位期间发表的学术论文目录  94-96
致谢  96-97
附录  97-107
外文论文  107-108
附件  108-133
学位论文评阅及答辩情况表  133

糖核苷酸的酶法合成与唾液酸糖肽的分离制备

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