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吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株构建

作　者: 周玉岩
导　师: 梁剑平
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 吉他霉素北里链霉菌生物合成基因簇基因工程菌株
分类号: TQ927
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

吉他霉素是一类由北里链霉菌产生的大环内酯类抗生素，在化学结构上由一个16元环内酯部分和两个相连的脱氧己糖部分构成。已经报道的吉他霉素有14个组分，不同组分的差别主要在于大环内酯部分有无乙酰化和脱氧己糖上面连接的各种不同基团。吉他霉素具有较强的抑菌活性，对革兰氏阳性菌、对革兰氏阴性菌、支原体、钩端螺旋体、立克次体等有抑制作用，应用在多种领域，尤其做为饲料的药物添加剂使用非常广泛。北里链霉菌1-9F是一株吉他霉素的生产菌株，为了阐明吉他霉素的生物合成途径和合成调节机制，首先对吉他霉素的生物合成基因簇进行了克隆。利用dTDP-葡萄糖合成酶的序列保守性，设计引物，用PCR从北里链霉菌总DNA中扩增出相应片段。构建了北里链霉菌的基因组文库，同样利用PCR方法从文库中筛选出一个含有dTDP-葡萄糖合成酶基因的柯斯质粒6E8，通过染色体步移，又筛选出柯斯质粒10F3和17G6，对这三个相互重叠的文库质粒进行了核酸序列测定。经过生物信息学分析，全长97kb的插入片段中包含51个开放阅读框。序列比对结果表明，Orf1-6及39-51可能和吉他霉素的生物合成无关。KitA是一个NDP-己糖-4-羰基还原酶；KitB是NDP-4-羰基-6-脱氧己糖-2,3-还原酶；KitC是NDP-己糖-3-甲基转移酶；KitD是甲氧基丙二酸合成蛋白；KitE是酰基辅酶A脱氢酶；KitF是酰基载体蛋白；KitG是3-羟基-酰基辅酶A脱氢酶；KitH是糖基转移酶；KitI是NDP-己糖-3,5-异构酶；KitJ是转醛羧酶；KitK和KitL都是转录调节因子；KitM是氧丁酰转移酶；KitN是NDP-己糖脱水酶；KitO是NDP-葡萄糖-4,6-脱水酶；KitP是dNDP-葡萄糖合成酶，这正是我们所利用的探针部分；KitQ是NDP-脱氧己糖氨基转移酶；KitR是NDP-脱氧己糖异构酶；KitS是细胞色素P450单加氧酶；KitT是一个可能的还原酶；KitU1-5就是合成吉他霉素聚酮骨架的完整I型聚酮合酶，共7个模块。根据这些蛋白的功能，推导出了两个脱氧己糖的生物合成途径和聚酮合酶作用中的一个特殊延伸单位甲氧基丙二酸酰基载体蛋白的合成过程以及完整的吉他霉素生物合成途径。目前，已经报道了多个基因工程菌株在抗生素发酵生产中应用的实例。分别从天蓝色链霉菌中克隆了腺苷甲硫氨酸合成酶基因（metK）和全局性调控基因adpA、从透明颤菌中克隆了血红蛋白基因vgb和从北里链霉菌中克隆的途径专一性调节基因kitK和kitL。将这些基因分别连接到能在链霉菌中稳定遗传的表达载体上，通过结合转移的遗传操作方式把这些表达质粒分别导入到吉他霉素生产菌株北里链霉菌1-9F中，构建出四株基因工程菌株。对这些工程菌株的生产抗生素水平进行测试，它们的效价比出发菌株都有大幅度提高，其中表达metK基因的菌株产量提高了44％。经过五代的传代培养，这些基因工程菌株都保持了良好的遗传稳定性，能够应用于工业化的发酵生产。

吉他霉素生物合成基因簇克隆与基因工程菌株构建

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