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新颖水解酶CESH的催化机制及其高效催化工艺研究

作　者: 潘海峰
导　师: 李永泉; 张建国
学　校: 浙江大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 顺式环氧琥珀酸水解酶 Bordetella Rhodococcus opacus 酒石酸筛选鉴定克隆优化响应面法固定化定点突变催化机制催化三联体
分类号: TQ203.2
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

顺式环氧琥珀酸水解酶(cis-epoxysuccinate hydrolase, CESH),是一种水解酶,能催化顺式环氧琥珀酸水解为酒石酸。酒石酸广泛应用于食品、医药、化工、纺织、电镀等行业,其需求量正在逐年递增,目前利用具有立体选择特异性的微生物来源CESH生产酒石酸已逐步成为酒石酸生产技术的新发展方向。本文概述了酒石酸和CESH的研究进展,并研究了新颖水解酶CESH的催化机制及其高效催化工艺。从田园土中筛选到一株产新颖CESH的野生菌,它能将顺式环氧琥珀酸立体特异性的转化为D(-)-酒石酸,经鉴定为博德特氏菌属(Bordetella),并命名为Bordetella sp. BK-52。对该野生菌产酶条件进行优化,最高酶活达764U/g。随后我们从该野生菌中分离纯化得到CESH,酶学性质研究显示,该酶具有温度稳定性好、pH稳定性范围广、金属离子耐受性好,立体特异性高等特点,表明该酶很适合作为工业生物催化剂。此外,我们还首次获得Bordetella sp. CESH的基因序列(GenBank登录号为EU053208)。根据上述CESH基因序列,构建基因工程菌,通过响应面法优化了CESH在大肠杆菌中的表达条件,使工程菌的酶活达到40129U/g,为野生菌的53倍。随后从12种细胞固定化方法中筛选到K-卡拉胶包埋法,通过响应面法优化其固定化条件,使固定化工程菌细胞的酶活回收率达83%。该固定化细胞对温度、pH、金属离子、表面活性剂等多种外界条件具有较强的稳定性,连续使用10批后,残余活力仍为93%,显示出良好的工业应用潜能与前景。红球菌(Rhodococcus opacus) CESH可催化顺式环氧琥珀酸生成L(+)-酒石酸。序列比对和二级结构预测分析显示,该CESH属于卤烷基脱卤酶超家族成员,29个保守位点的定点突变实验、圆二色谱分析、立体特异性分析和酶学性质分析证实,下列9个氨基酸在该酶催化过程中起重要作用：Aspl8、Aspl93、Arg55、Lysl64、Hisl90、Thr22、Tyrl70、Asnl34和Alal88。同位素H218O标记的单转化和多转化实验表明,在水解过程中,水分子中的O原子首先转移到酶中,然后再转移到产物中。接着预测了Rhodococcus opacus CESH的三维结构,整体三维结构和重要活性位点的重叠结果显示,该酶与一些三维结构已知的卤烷基脱卤酶(Hdl、L-DEX和Dh1B)的结构非常相似,采用两步法的催化机制,并推测该催化机制通过催化三联体Asp18-His190-Asp193进行,即CESH中的Asp18首先亲核进攻底物顺式环氧琥珀酸,形成“底物-酶酯中间体”,接着位于活性位点的His190和Asp193激活水分子,进一步水解酯键,并释放产物L(+)-酒石酸。

全文目录

致谢  5-6
英文缩写词表  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
目录  11-14
第一章文献综述  14-38
  1.1 酒石酸的分类  14
  1.2 酒石酸的制备方法  14-17
    1.2.1 L(+)-酒石酸的制备方法  14-15
    1.2.2 D(-)-酒石酸的制备方法  15-16
    1.2.3 DL-酒石酸和meso-酒石酸的制备方法  16-17
  1.3 生物转化法生产酒石酸的工艺流程  17
  1.4 顺式环氧琥珀酸水解酶  17-18
  1.5 环氧化物水解酶  18-31
    1.5.1 环氧化物水解酶的分类  19
    1.5.2 α/β水解酶折叠结构  19-22
    1.5.3 环氧化物水解酶的催化机制  22
    1.5.4 环氧化物水解酶的催化三联体  22-23
    1.5.5 环氧化物水解酶的实例例举  23-31
      1.5.5.1 A.radiobacter AD1环氧化物水解酶  23-27
      1.5.5.2 鼠可溶性环氧化物水解酶  27-31
  参考文献  31-38
研究目的及意义  38-39
研究内容  39-40
技术路线  40-42
第二章 CESH产生菌选育、产酶条件优化及酶学性质研究  42-72
  2.1 引言  42
  2.2 实验材料和方法  42-49
    2.2.1 实验材料  43-44
    2.2.2 CESH产生菌的选育  44-45
    2.2.3 CESH产生菌产酶条件优化  45-46
    2.2.4 CESH基因工程菌的构建  46-47
    2.2.5 CESH酶学性质研究  47-48
    2.2.6 测定方法  48-49
  2.3 实验结果  49-62
    2.3.1 CESH产生菌的选育  49-52
    2.3.2 CESH产生菌产酶条件优化  52-56
    2.3.3 CESH基因工程菌的构建  56-59
    2.3.4 CESH酶学性质研究  59-62
  2.4 讨论  62-66
  参考文献  66-72
第三章 CESH基因工程菌高效催化工艺研究  72-98
  3.1 引言  72-73
  3.2 实验材料和方法  73-77
    3.2.1 实验材料  73-74
    3.2.2 测定方法  74
    3.2.3 实验设计和优化  74-76
    3.2.4 酶学性质研究  76-77
  3.3 实验结果和讨论  77-92
    3.3.1 种子条件的优化  77-79
    3.3.2 诱导条件的优化  79-85
    3.3.3 固定化条件的优化  85-88
    3.3.4 固定化细胞与游离细胞的比较  88-92
  3.4 讨论  92-95
  参考文献  95-98
第四章 CESH的催化机制研究  98-116
  4.1 引言  98-99
  4.2 实验材料和方法  99-102
    4.2.1 实验材料  99
    4.2.2 实验方法  99-102
  4.3 实验结果  102-106
    4.3.1 CESH序列比对和二级结构预测  102-104
    4.3.2 突变型CESH的构建和表达  104
    4.3.3 酶学性质研究  104-106
    4.3.4 催化机制研究  106
  4.4 讨论  106-112
  参考文献  112-116
结论与展望  116-119
作者简历  119-120

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