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花生根际土壤细菌群落结构分析

作　者: 王文铜
导　师: 丁延芹
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 铁载体产生菌花生根际细菌群落结构 T-RFLP 16S rDNA
分类号: S154.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

为研究花生根际细菌群落结构与根际土壤理化性质的相互关系，以及花生根际铁载体产生菌的分布规律及其遗传多样性，筛选能够活化土壤有效铁的菌种，本研究在山东省的棕壤、潮土、褐土、砂姜黑土等四种土壤类型设置采样点，分别采集正常花生植株样品和黄化花生植株样品根际土壤，同时在棕壤上采集非根际土壤，共9个样品。利用分离筛选铁载体产生菌和ARDRA的方法分析了花生根际铁载体产生菌的遗传多样性，采用T-RFLP和构建16S rDNA文库的方法，结合PCA（主成分分析）、CCA（典型对应分析）等统计学方法探讨了影响花生根际细菌群落结构的影响因素。本文从花生根际土壤中筛选出139株铁载体产生菌分别属于厚壁菌、拟杆菌、γ-变形杆菌、芽单胞菌、疣微菌、放线菌、和β-变形杆菌等7个大类群。其中芽孢杆菌有38株，假单胞菌20株，总共占据了42%，是明显的优势菌群。90%以上的芽孢杆菌只在黄化花生样品的根际土中发现，而假单胞菌在所有样品中都有发现。结果显示，芽孢杆菌和假单胞菌属是产生铁载体能力比较强的菌属。T-RFLP和16S rDNA分析表明，山东省花生根际细菌群落由12个细菌类群组成，包括：变形杆菌（Proteobacteria，包括α、β、δ和γ亚门）、酸杆菌（Acidobacteria）、浮霉菌（Planctomycetes）、拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌（Nitrospira）、绿弯菌（Chloroflexi）、芽单胞菌（Gemmatimonadetes）、蓝藻（Cyanobacteria）、放线菌（Actinobacteria）以及部分待划分类群。酸杆菌和厚壁菌在9个文库中占据优势地位。基于16S rDNA克隆文库的多样性指数分析和PCA分析表明，非根际土与根际土样品间的细菌群落结构相差很大，表明花生根系活动对根际细菌群落结构的影响最大；所有根际土样品间，黄化花生和正常花生根际群落结构不同，不同土壤类型之间的细菌群落结构相差较小。CCA和RDA分析结果表明，土壤中的铁元素含量和pH是与花生根际土细菌群落结构相关性较强的环境因子。γ-变形杆菌、厚壁菌、α-变形杆菌、放线菌、β-变形杆菌、拟杆菌、蓝藻门、芽单胞菌、酸杆菌等与铁、铜、有机质、腐殖质呈现正相关，与锰、锌、铵态氮、硝态氮、pH等元素呈现负相关；而δ-变形杆菌、疣微菌、硝化螺旋菌、绿弯菌和浮霉菌类群则都与铁、铜、有机质、腐殖质呈现负相关，与锰、锌、铵态氮、硝态氮、pH等元素呈现正相关；钾元素与所有的细菌类群没有明显的相关性。本研究为利用微生物活化土壤有效铁，缓解缺铁引起的花生黄化病提供了理论依据，丰富了农业微生物菌种资源。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-30
  1.1 花生黄化病概述  13-16
    1.1.2 花生黄化病发生原因  13-14
    1.1.3 花生黄化病的防治  14-15
      1.1.3.1 科学施肥  14
      1.1.3.2 合理浇水，加强田间管理  14-15
      1.1.3.3 化学手段  15
    1.1.4 铁的生理机能和铁的生物有效性  15-16
  1.2 铁载体及铁载体产生菌研究概述  16-18
    1.2.1 铁载体的作用  16-17
    1.2.2 植物根际铁载体产生菌的研究  17-18
  1.3 细菌多样性概述  18-19
  1.4 细菌多样性分析方法  19-26
    1.4.1 环境基因组 16S rDNA 的 PCR 扩增  20-22
    1.4.2 16S rDNA 文库  22-25
    1.4.3 T-RFLP（Terminal restriction fragment length polymorphism）  25-26
  1.5 生物群落多样性的测度  26-27
    1.5.1 物种丰富度  26
    1.5.2 物种多样性指数  26-27
    1.5.3 物种均匀度指数  27
  1.6 生物群落梯度分析  27-29
    1.6.1 直接梯度分析  27
    1.6.2 间接梯度分析（Indirect gradient analysis）  27-28
    1.6.3 约束直接梯度分析（Constrained direct gradient analysis）  28-29
      1.6.3.1 冗余分析  28
      1.6.3.2 典型对应分析  28-29
  1.7 本文选题依据及研究意义  29-30
2 材料与方法  30-41
  2.1 生化试剂  30
  2.2 仪器设备  30
  2.3 样品的采集  30-31
  2.4 主要溶液及培养基的配制  31-32
    2.4.1 LB（Luria-Bertani）培养基  31
    2.4.2 氨苄青霉素（Amp）溶液  31
    2.4.3 X-Gal 贮液  31
    2.4.4 IPTG 贮液  31
    2.4.5 铁载体检测（CAS 法）试剂  31-32
  2.5 样品理化指标的测定  32
  2.6 PCR 引物  32
  2.7 样品总 DNA 的提取及 16S rDNA 的 PCR 扩增  32-33
    2.7.1 样品总 DNA 的提取  32-33
    2.7.2 16S rDNA 的 PCR 扩增  33
    2.7.3 PCR 扩增的反应条件  33
    2.7.4 PCR 扩增产物的纯化  33
  2.8 T-RFLP 分析  33-34
    2.8.1 荧光 PCR 产物的限制性酶切  33-34
    2.8.2 酶切产物的基因扫描  34
  2.9 16S rDNA 文库  34-36
    2.9.1 PCR 产物的连接  34
    2.9.2 E.coli DH5 感受态细胞的制备（氯化钙法）  34
    2.9.3 转化  34-35
    2.9.4 阳性克隆的筛选  35
    2.9.5 ARDRA 分型  35-36
  2.10 铁载体产生菌的检测及筛选  36-37
    2.10.1 筛选铁载体产生菌  36
    2.10.2 基因组 DNA 的提取  36-37
    2.10.3 ARDRA 分型  37
  2.11 数据分析  37-40
    2.11.1 T-RFLP 分析  37-39
      2.11.1.1 细菌群落多样性分析  37-38
      2.11.1.2 去趋势对应分析（DCA）  38
      2.11.1.3 典型对应分析（CCA）  38-39
    2.11.2 16s rDNA 克隆文库分析  39-40
      2.11.2.1 序列分析  39
      2.11.2.2 文库统计数据分析  39-40
  2.12 铁载体产生菌的 ARDRA 分析  40
  2.13 核苷酸序列登录号  40-41
3 结果与分析  41-57
  3.1 花生根际土壤环境特征  41-42
  3.2 T-RFLP 分析  42-46
    3.2.1 样品的 T-RFLP 图谱分析  42-43
    3.2.2 多样性指数分析  43
    3.2.3 T-RFLP 图谱中主要片段的定性分析  43-44
    3.2.4 基于 T-RFLP 的主成分分析  44-45
    3.2.5 T-RFs 分布与根际土环境因子之间的关系（CCA 分析）  45-46
  3.3 16S rDNA 克隆文库分析  46-53
    3.3.1 文库的构建  46-48
      3.3.1.1 阳性克隆子的验证  46-47
      3.3.1.2 16S rDNA 扩增片段的 ARDRA 分型  47
      3.3.1.3 嵌合体检测及库容的估算  47-48
    3.3.2 基于 16S rDNA 克隆文库的细菌多样性分析  48-51
      3.3.2.1 花生根际土壤细菌群落结构分析  48-51
      3.3.2.2 基于 16S rDNA 文库的细菌多样性指数分析  51
    3.3.3 土壤细菌群落与环境因子之间的关系（RDA 分析）  51-53
  3.4 花生根际土壤中铁载体产生菌的遗传多样性分析  53-57
4 讨论  57-61
  4.1 花生根际土壤样品的理化性质  57
  4.2 花生根际土细菌群落结构分析  57-60
    4.2.1 花生根际土中铁载体产生菌的分析  57-58
    4.2.2 花生根际细菌群落结构分析  58-60
  4.3 细菌群落结构分析方法的比较  60-61
5 结论  61-63
  5.1 花生根际铁载体产生菌多样性  61
  5.2 花生根际土壤中的细菌群落结构  61
  5.3 花生土壤细菌群落结构的影响因素  61
  5.4 分子生物学方法的比较  61-63
参考文献  63-74
附录  74-83
致谢  83

花生根际土壤细菌群落结构分析

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