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蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢及抗逆性能的调控作用机制

作 者: 冯宇
导 师: 陈启和
学 校: 浙江大学
专 业: 食品工程
关键词: 单倍体酿酒酿酒 蛋白酶A 糖代谢 抗逆性能 蛋白质组学
分类号: Q93
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
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内容摘要


酿酒酵母蛋白酶A是酿酒酵母PEP4基因编码,是一种天冬氨酸蛋白酶,属于胃蛋白酶A家族。酵母液泡中的蛋白酶A能催化蛋白质水解,特别是在氮缺乏、孢子形成时,蛋白酶A能够通过水解蛋白质为孢子新蛋白的合成提供氨基酸来源。在液泡中,酵母蛋白酶A参与多种酶的转录后加工作用,对液泡中其他液泡酶的成熟激活过程有着重要的作用。此外,目前越来越多的人对蛋白酶A在酿酒酵母细胞中发挥的独特作用进行了研究,也逐渐地意识到蛋白酶A在酿酒酵母细胞中发挥的重要作用。但是,对于蛋白酶A在单倍体酿酒酵母细胞基础代谢中的调控及其调控机制目前还研究得比较少。基于此,笔者就蛋白酶A对酿酒酵母的基础代谢:糖代谢及抗逆性能的调控作用进行了比较深入的研究。本论文研究内容主要包括以下几个方面,分别为蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢关键酶酶活的影响,对糖代谢关键酶基因表达量的影响(采用实时荧光定量PCR技术),对酿酒酵母蛋白表达的影响(采用蛋白质双向电泳和飞行质谱鉴定技术),对酿酒酵母抗氧化、抗辐射性的影响,以及在低氮条件下蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢关键酶的影响。通过研究发现,蛋白酶A的敲除使得单倍体酿酒酵母细胞糖代谢中关键酶的比活上调,即蛋白酶A的敲除对糖代谢中六个关键酶的比活起到了正调控作用;蛋白酶A的敲除引起了柠檬酸合酶(CS)和a-酮戊二酸脱氢酶(a-KGDHC)基因的表达上调,己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和异柠檬酸脱氢酶(ICD)基因表达的下调,还可能影响到这些酶的翻译及翻译后的相关加工修饰等过程;通过蛋白质组学鉴定发现,参与代谢途径最多且蛋白表达下调最为显著的涉及到糖代谢的蛋白主要有果糖二磷酸醛缩酶(Fbalp)、烯醇化酶(Eno2p)和丙酮酸脱羧酶(Pdclp).而进一步通过荧光定量PCR鉴定发现Pdclp是受到蛋白酶A影响最为明显的糖代谢酶。结合酵母细胞的代谢流程图可以推断蛋白酶A的敲除可以影响到酵母细胞的整个生化代谢途径;在低氮条件下,蛋白酶A的敲除使得菌株较早地发生自溶或者裂解,从而使胞内外蛋白含量均发生变化,同时菌株中丙酮酸激酶的比活下降,己糖激酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合酶和烯醇化酶的比活上升;在氧化和辐射条件下,蛋白酶A的敲除引起了酿酒酵母的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶酶活下降,意外地是引起了酵母细胞内海藻糖的积累。由此可见,在逆境条件下,蛋白酶A的敲除对海藻糖的合成与分解动态平衡有着重要的调节作用。

全文目录


致谢  11-12
摘要  12-14
ABSTRACT  14-16
1 前言  16-22
  1.1 酵母中蛋白酶A的研究进展  16-20
    1.1.1 酵母蛋白酶A的结构  16
    1.1.2 酵母蛋白酶A的生化特性  16-17
    1.1.3 蛋白酶A的分泌及加工修饰过程  17-18
    1.1.4 酵母蛋白酶A的生物学功能研究  18-20
  1.2 选题背景与研究思路  20-22
2 蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢关键酶活性的影响  22-31
  2.1 前言  22-23
  2.2 材料与方法  23-26
    2.2.1 菌株  23
    2.2.2 培养基  23
    2.2.3 主要试剂与仪器  23
    2.2.4 细胞生长和降糖实验  23-24
    2.2.5 恒化培养实验  24
    2.2.6 无细胞酶液的制备  24
    2.2.7 关键酶酶活的测定  24-26
  2.3 结果与讨论  26-30
    2.3.1 正常培养条件下原始菌与突变酿酒酵母细胞的生长和降糖情况  26-27
    2.3.2 恒化培养条件下酵母菌体的生长和降糖情况  27-28
    2.3.3 原始菌与蛋白酶A敲除的突变酵母EMP途径三个关键酶活的比较  28-29
    2.3.4 单倍体酿酒酵母细胞TCA途径三个关键酶活的比较  29-30
  2.4 本章小结  30-31
3 蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢中关键酶基因表达的影响  31-38
  3.1 前言  31
  3.2 材料与方法  31-34
    3.2.1 酵母菌株  31-32
    3.2.2 主要试剂与仪器  32
    3.2.3 RNA抽提  32
    3.2.4 反转录  32-33
    3.2.5 荧光定量PCR检测  33-34
  3.3 结果与讨论  34-37
  3.4 本章小结  37-38
4 蛋白酶A敲除对酿酒酵母蛋白表达及糖代谢的调控影响  38-49
  4.1 前言  38
  4.2 材料与方法  38-41
    4.2.1 菌株  38
    4.2.2 培养基  38-39
    4.2.3 主要试剂  39
    4.2.4 主要仪器设备  39
    4.2.5 菌体样品制备  39-40
    4.2.6 蛋白的提取和蛋白浓度的测定  40
    4.2.7 双向电泳  40
    4.2.8 蛋白鉴定  40-41
  4.3 结果与讨论  41-47
    4.3.1 蛋白质双向电泳结果与分析  41-43
    4.3.2 差异蛋白点GO分析  43-45
    4.3.3 差异蛋白点KEGG Pathway分析  45-46
    4.3.4 糖代谢途径三个重要酶的基因在转录水平上的表达量鉴定和比较  46-47
  4.4 本章小结  47-49
5 低氮胁迫下蛋白酶A敲除对酿酒酵母糖代谢关键酶的影响  49-58
  5.1 前言  49
  5.2 材料与方法  49-51
    5.2.1 菌株  49
    5.2.2 培养基  49-50
    5.2.3 主要试剂与仪器  50
    5.2.4 细胞生长和降糖规律试验  50
    5.2.5 无细胞酶液的制备  50
    5.2.6 胞内外蛋白浓度的测定  50-51
    5.2.7 低氮条件下酿酒酵母糖代谢中关键酶比活的测定  51
  5.3 结果与讨论  51-57
    5.3.1 低氮胁迫下对照酵母与蛋白酶A敲除的突变菌生长和残糖浓度的比较  51-52
    5.3.2 低氮胁迫下发酵液中粗蛋白含量比较  52-53
    5.3.3 低氮胁迫条件下胞内蛋白含量比较  53-54
    5.3.4 低氮胁迫条件下糖代谢中关键酶比活的测定结果  54-57
  5.4 本章小结  57-58
6 蛋白酶A敲除对酿酒酵母细胞抗氧化性能的影响  58-68
  6.1 前言  58
  6.2 材料与方法  58-61
    6.2.1 菌株  58
    6.2.2 培养基  58-59
    6.2.3 主要试剂与仪器  59
    6.2.4 不同过氧化氢浓度下酿酒酵母生长情况比较  59
    6.2.5 无细胞酶液的制备  59-60
    6.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定  60
    6.2.7 过氧化氢酶(CAT)活性的测定  60
    6.2.8 胞内蛋白浓度的测定  60-61
    6.2.9 海藻糖浓度的测定  61
  6.3 结果与讨论  61-67
    6.3.1 不同浓度过氧化氢处理下PrA敲除酿酒酵母与对照菌的细胞生长比较  61-63
    6.3.2 氧化胁迫下蛋白酶A敲除的酵母细胞SOD活性分析  63-64
    6.3.3 氧化胁迫下蛋白酶A敲除酵母细胞的过氧化氢酶活性分析  64
    6.3.4 氧化胁迫下蛋白酶A敲除的酿酒酵母胞内蛋白浓度变化  64-65
    6.3.5 氧化胁迫下蛋白酶A敲除的酵母细胞胞内海藻糖分析  65-67
  6.4 本章小结  67-68
7 蛋白酶A敲除对酿酒酵母细胞抗辐射性的影响  68-77
  7.1 前言  68
  7.2 材料与方法  68-71
    7.2.1 菌株  68-69
    7.2.2 培养基  69
    7.2.3 主要试剂与仪器  69
    7.2.4 不同辐射剂量下酵母生长情况比较  69
    7.2.5 无细胞酶液的制备  69-70
    7.2.6 超氧化物歧化酶SOD活性的测定  70
    7.2.7 过氧化氢酶CAT活性的测定  70
    7.2.8 海藻糖浓度的测定  70-71
    7.2.9 胞内蛋白浓度的测定  71
  7.3 结果与讨论  71-76
    7.3.1 不同辐射剂量下酵母生长情况比较和分析  71-72
    7.3.2 辐射处理下超氧化物歧化酶活性检测结果  72-73
    7.3.3 过氧化氢酶CAT活性测定试验结果  73-74
    7.3.4 海藻糖浓度测定结果及其分析  74-75
    7.3.5 胞内蛋白浓度测定结果及其分析  75-76
  7.4 本章小结  76-77
8 总结与展望  77-79
  8.1 主要研究结论  77-78
  8.2 后续研究展望  78-79
参考文献  79-88
作者简历  88
研究生阶段取得的主要学术成果  88-89
附录表Ⅰ  89-101

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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