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人前皮细胞及NB4细胞重编程的研究

作　者: 杨柳笛
导　师: 徐建民
学　校: 复旦大学
专　业: 内科学
关键词: 诱导性多潜能干细胞重编程胚胎干细胞肿瘤干细胞急性早幼粒细胞白血病
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

背景和目的：白血病的复发是世界性难题,药物只能杀死普通肿瘤细胞,而白血病干细胞能够逃逸其杀伤作用,条件适宜时又会重新增殖、分化,导致白血病不易根治。天然白血病干细胞稀少且很难分选,体外培养也不易成功。诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是近年来干细胞领域的突破性进展。iPSCs与人类胚胎干细胞建系、体细胞核移植、成体干细胞的发现、肿瘤干细胞的发现等被评为干细胞研究领域最近三十年来的十大成就,在再生医学、建立疾病模型、药物筛选等研究领域都有很高的应用价值。本实验拟通过iPSCs的方法,建立急性早幼粒细胞白血病细胞的诱导性多潜能肿瘤细胞,可为今后研究药物对白血病肿瘤干细胞的作用机制提供平台,为攻克白血病提供可能。国内外从诱导性多潜能肿瘤细胞这一角度研究白血病的学者不多,这是本实验的创新性所在。材料和方法：1)用pMX-Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc/GFP, pMX-Gag-pol, pMX-VSVG及相关转染试剂转染293FT细胞,包装携带目的cDNA的逆转录病毒。收集、浓缩病毒后一次性感染人前皮细胞。感染完毕通过GFP标记、流式细胞技术评估感染效率。将转基因的人前皮细胞与MEF细胞共培养,出现细胞克隆后挑出状态好的细胞克隆建立iPS细胞系。对建系的iPSCs进行鉴定：①AP染色②rt-PCR③核型分析④畸胎瘤形成实验。2)悬浮培养NB4细胞。收集、浓缩病毒后每24小时感染NB4细胞一次,共三次。末次病毒感染后12～24小时用流式细胞技术评估感染效率。将转基因的NB4细胞与HFF-feeder共培养,隔日换液并定期观察细胞生长状态,对细胞进行形态及分子生物学鉴定。结果：1)人前皮细胞被携带Yamanaka因子(Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc)的逆转录病毒感染后,转变为形态与人胚胎干细胞相似的干细胞：细胞呈克隆样生长,细胞间排列紧密界限不清,与周围饲养层细胞分界清楚。对人前皮细胞来源的iPSCs进行干性鉴定,结果如下：①碱性磷酸酶染色阳性。②rt-PCR干性基因表达与阳性对照(人胚胎干细胞)相同：内源性高表达Nanog,Oct4,Sox2,Klf4,c-Myc等干性基因；阴性对照MEF细胞未出现以上干性基因表达。③核型分析：对50个iPSCs进行核型分析,其中两个细胞染色体数目异常,分别为45和48条；其余细胞染色体数目正常,为46条。④畸胎瘤实验：向NOD/SCID小鼠皮下注射iPSCs,8周左右可形成畸胎瘤,制成石蜡切片经HE染色后可见腺体、肌肉、神经组织等内、中、外胚层的组织。2)逆转录病毒携带Yamanaka因子,用三轮重复感染方法感染NB4细胞；GFP标记、流式细胞分析表明每种病毒感染NB4细胞的效率可达到60%-65%。将转入Yamanaka因子的NB4细胞与HFF-feeder共培养12天左右,细胞成簇贴壁,但与hES细胞形态不尽相同。对成簇贴壁生长的NB4细胞进行rt-PCR检测,其Nanog基因表达水平介于普通NB4细胞和hES细胞之间,内源性Yamanaka因子表达与NB4细胞相同。结论：1)以逆转录病毒作为载体,携带Yamanaka因子,可以将人前皮细胞重编程为诱导性多潜能干细胞。重编程的人前皮细胞在AP染色、rt-PCR干性基因表达、畸胎瘤形成等鉴定细胞多能性试验中均表现出与人胚胎干细胞相同的生物学特性,且多具有正常核型。2)以逆转录病毒作为载体,将Yamanaka因子转入急性早幼粒细胞白血病NB4细胞,采用三次感染体系,每种病毒感染NB4细胞的效率可达到60%～65%。3)转基因的NB4细胞与HFF-feeder共培养,通过细胞生长形态及基因表达鉴定,实现NB4细胞部分重编程。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
引言  8-13
第一部分人前皮细胞重编程  13-29
  前言  13
  材料和方法  13-28
  结果  28-29
第二部分 NB4细胞重编程  29-37
  前言  29-31
  材料和方法  31-36
  结果  36-37
讨论  37-40
结论  40-41
后记  41-45
参考文献  45-47
综述：诱导性多潜能干细胞在血液学的研究进展  47-56
  参考文献  53-56
附录  56-57
大事记  57-58
致谢  58-59

人前皮细胞及NB4细胞重编程的研究

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