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通读表达具有催化三联体的含硒单链抗体及其生物学效应研究

作　者: 徐亚维
导　师: 牟颖; 罗贵民
学　校: 吉林大学
专　业: 生物物理学
关键词: 谷胱甘肽过氧化物酶硒代半胱氨酸单链抗体催化三联体通读表达
分类号: Q814
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

在机体的抗氧化防御酶系中，谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）发挥着重要作用，它能高效清除过氧化氢和有机氢过氧化物。但天然GPx的催化基团硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）是终止密码子UGA编码的，难以用DNA重组法进行表达的缺点使其来源非常有限，因此许多科学工作者都致力于GPx的人工模拟研究。本课题组曾经采用化学诱变法、半胱氨酸营养缺陷型表达法制备了多种GPx模拟物，含硒单链抗体Se-scFv2F3是优秀的代表。但这两种方法分别使scFv-2F3中所有的丝氨酸和所有的半胱氨酸都被变成Sec，无法实现准确的定位和定量。为了解决上述问题，本文依据大肠杆菌自身的Sec掺入机制，利用通读表达手段获得含硒单链抗体Se-scFv2F3，从而实现Sec的准确定位和定量。由于天然GPx的活性中心具有Sec（U）、Gln（Q）和Trp（W）构成的催化三联体，其对于稳定催化中间体和发挥酶的催化活力至关重要。为了获得高效的GPx模拟物并研究其催化作用，本研究将催化三联体引入到上述通读表达的Se-scFv2F3中，并研究了该含硒单链抗体（Se-scFv-WUQ）的生物学效应。1利用生物信息学手段，通过理论预测发现单链抗体scFv-2F3的活性部位Ser52可能和Phe29及Gln72形成类似天然GPx的催化三联体结构，从而稳定其催化结构及提高活性。本研究采用PCR方法构建了催化三联体并在其下游引入在大肠杆菌中表达异源硒蛋白必须的最小SECIS元件，与四个参与通读的反式作用因子SelA，SelB，SelC和SelD共表达，实现了具有催化三联体的含硒单链抗体Se-scFv-WUQ中Sec的定位表达。其展示出较好的GPx活性，活力为872U/μmol。通过探索催化三联体中各个氨基酸的催化贡献为研究天然GPx的催化机理及设计更有效的模拟酶奠定理论和实验基础。2建立细胞器和细胞水平的氧化损伤模型，研究了Se-scFv-WUQ对H2O2诱导心肌线粒体和L02肝细胞氧化损伤的保护作用。结果表明Se-scFv-WUQ对心肌线粒体和L02细胞的氧化损伤均具有一定的保护作用，可以降低细胞内MDA生成、提高损伤细胞存活率等，研究结果表明Se-scFv-WUQ可以在细胞水平发挥和天然GPx类似的功能。3分别研究了GPx的小分子模拟物6-CySeCD对H2O2诱导损伤小鼠成纤维细胞（NIH3T3细胞）和UVB诱导损伤人永生化表皮细胞（HaCaT细胞）的保护作用。结果表明6-CySeCD能明显保护NIH3T3和HaCaT细胞免受氧化损伤，初步阐明了6-CySeCD保护NIH3T3和HaCaT细胞的作用机制，为深入揭示6-CySeCD的生物学作用机制奠定了基础。本研究获得了具有类似天然GPx催化三联体结构的含硒单链抗体Se-scFv-WUQ，实现了其在大肠杆菌宿主中通读表达。Sec在蛋白质中的定位表达，对研究天然GPx的催化机制和设计高效模拟物提供理论支撑。生物学效应的研究也表明Se-scFv-WUQ可以在亚细胞和细胞水平上发挥和天然GPx类似的功能,具有深入开展药理研究的潜力。

全文目录

提要  4-7
中文摘要  7-16
ABSTRACT  16-40
第一章绪论  40-126
  1.1 硒蛋白的研究进展  40-71
    1.1.1 硒蛋白的分类  41-55
    1.1.2 硒代半胱氨酸的生物合成机制  55-64
    1.1.3 硒代半胱氨酸插入元件  64-67
    1.1.4 硒蛋白的表达  67-71
  1.2 谷胱甘肽过氧化物模拟酶  71-91
    1.2.1 GPx 结构  72-77
    1.2.2 GPx 的催化机制  77-79
    1.2.3 化学合成 GPx 模拟物  79-82
    1.2.4 含硒抗体模拟 GPx  82-91
  参考文献  91-126
第二章本论文立论依据  126-140
  参考文献  132-140
第三章具有催化三联体的含硒单链抗体 SE-SCFV-WUQ 通读表达系统的构建  140-178
  3.1 前言  140-144
  3.2 实验材料  144-146
    3.2.1 菌株和质粒  144
    3.2.2 主要试剂  144-145
    3.2.3 主要仪器  145-146
    3.2.4 培养基和主要溶液的配制  146
  3.3 实验方法  146-156
    3.3.1 含硒单链抗体通读表达突变体的结构预测及获得  146-148
    3.3.2 pPelB-Se-scFv-U 质粒的小剂量提取  148-150
    3.3.3 含硒单链抗体基因的定点突变  150-152
    3.3.4 低温 CaCl_2法制备 E. coli DH5α感受态细胞  152-153
    3.3.5 含硒单链抗体基因突变产物转化感受态细胞  153-154
    3.3.6 含硒单链抗体基因突变产物的筛选和酶切鉴定  154-155
    3.3.7 含硒单链抗体基因突变体的酶切鉴定  155
    3.3.8 含硒单链抗体突变体基因的酶切产物回收  155-156
    3.3.9 含硒单链抗体突变体基因的测序  156
  3.4 结果分析  156-163
    3.4.1 含硒单链抗体通读表达突变体的设计  156-160
    3.4.2 含硒单链抗体通读表达突变体的鉴定  160-161
    3.4.3 含硒单链抗体通读表达突变体基因的定点突变  161-163
  3.5 讨论  163-170
  本章小结  170-171
  参考文献  171-178
第四章通读表达具有催化三联体的含硒单链抗体 SE-SCFV-WUQ  178-230
  4.1 前言  178-183
  4.2 实验材料  183-189
    4.2.1 主要试剂  183-184
    4.2.2 主要仪器  184-185
    4.2.3 质粒和菌株  185
    4.2.4 主要溶液配制  185-189
  4.3 实验方法  189-201
    4.3.1 通读表达载体共转化感受态细胞的制备  189-190
    4.3.2 含硒单链抗体通读表达载体的共转化  190-191
    4.3.3 含硒单链抗体诱导表达条件的优化  191-192
    4.3.4 含硒单链抗体各突变体的诱导表达  192-193
    4.3.5 可溶性含硒单链抗体的纯化  193-195
    4.3.6 纯化蛋白的 Western blotting 鉴定  195-197
    4.3.7 含硒单链抗体蛋白质和硒含量测定  197-199
    4.3.8 含硒单链抗体 GPx 活力和动力学分析  199-201
  4.4 结果分析  201-213
    4.4.1 Se-scFv-WUQ 表达条件的优化  201-207
    4.4.2 含硒单链抗体的纯化  207-208
    4.4.3 含硒单链抗体的 Western blotting 分析  208
    4.4.4 含硒单链抗体 GPx 活性和硒含量比较  208-212
    4.4.5 含硒单链抗体动力学分析  212-213
  4.5 讨论  213-220
  本章小结  220-222
  参考文献  222-230
第五章含硒单链抗体 SE-SCFV-WUQ 生物学效应研究  230-258
  5.1 前言  230-233
  5.2 SE-SCFV-WUQ 对牛心肌线粒体氧化应激损伤的保护  233-237
    5.2.1 实验材料  233-234
    5.2.2 实验方法  234-235
    5.2.3 结果与讨论  235-237
  5.3 SE-SCFV-WUQ 对氧化应激损伤肝细胞的生物学效应  237-247
    5.3.1 实验材料  237-238
    5.3.2 实验方法  238-241
    5.3.3 结果与讨论  241-247
  本章小结  247-248
  参考文献  248-258
第六章 GPX 模拟物 6-CYSECD 的生物学效应  258-286
  6.1 前言  258-262
  6.2 6-CYSECD 对 UVB 诱导的人永生化表皮 HACAT 细胞损伤的保护作用  262-270
    6.2.1 实验材料  262-263
    6.2.2 实验方法  263-264
    6.2.3 结果与讨论  264-270
  6.3 6-CYSECD 对过氧化氢诱导小鼠成纤维细胞损伤的保护作用  270-276
    6.3.1 实验材料  270-271
    6.3.2 实验方法  271-272
    6.3.3 结果与讨论  272-276
  本章小结  276-277
  参考文献  277-286
作者简介  286-287
攻读博士期间的科研成果  287-292
致谢  292-295

通读表达具有催化三联体的含硒单链抗体及其生物学效应研究

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