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家蚕Hedgehog信号通路相关基因的克隆、鉴定及其功能分析

作　者: 郝向伟
导　师: 崔红娟
学　校: 西南大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 家蚕中肠实时荧光定量PCR Hedgehog信号通路表达特征
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

Hedgehog (Hh)信号通路最早发现于果蝇,其在果蝇胚胎形成和发育过程中有着重要的作用；在哺乳动物中,Hh信号的异常往往导致出生后的缺陷和癌症。Hh信号通路在胚胎发育、组织修复、癌症发生等过程中有着重要的作用。Hh信号通路广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物体内,在进化上,Hh信号通路具有高度的保守性,相关基因在各物种之间之间具有高度的同源性。近期研究表明Hh信号通路参与组织损伤后的修复,参与肠道干细胞的维持。而家蚕中关于Hh信号通路的研究几乎没有报道。家蚕是鳞翅目昆虫的模式生物,同时也是重要的经济昆虫。近年来,干细胞的研究成为人们关注的焦点,而关于家蚕干细胞的研究很少。家蚕中肠是家蚕更新最快的器官之一,开展家蚕中肠干细胞调控机制的研究具有重要的意义。本研究以家蚕基因组精细图和家蚕基因组数据库为基础,通过生物学信息分析和RACE技术对家蚕中Hedgehog信号通路的同源基因进行了分析和克隆,并对其功能进行了初步的探讨,得到了以下研究结果：1.家蚕Hh信号通路同源基因的克隆及鉴定本实验在通过生物学信息分析的基础上,鉴定了家蚕中与Hh、Ptch、Smo和Ci基因具有高度同源的基因,分别命名为BmHh、BmPtch、BmSmo和BmCi。通过RACE技术分别获得了上述基因的5’端和3,端序列,通过拼接获得了这四个基因的全长cDNA序列。BmHh基因的全长cDNA为3172bp,位于第9号染色体,全长ORF框为1149bp,编码382个氨基酸,预测蛋白质的分子量大小为42.4KD,等电点为8.70。BmHh含有两个典型的HH-N和HH-C端结构域,通过进行多序列比对分析构建系统进化树,结果显示,BmHh在昆虫中具有高度保守性。BmPtch位于第3号染色体,全长ORF框为3702bp,编码1233个氨基酸,预测分子量为137.4KD; BmSmo基因的全长cDNA为3009bp,位于3号染色体上,全长ORF框为2613bp,编码857个氨基酸,预测分子量为97.3KD,等电点为9.40；BmCi基因的全长cDNA为6285bp,位于27号染色体上,全长ORF框为4716bp,编码1572个氨基酸,预测分子量为170.3KD,等电点为7.17。对各物种同源序列进行多重序列比对分析并构建系统发生树结果显示,Hh、Ptch、Smo、Ci从无脊椎动物到脊椎动物,都具有保守性,昆虫中的对应的同源基因只有一个,由于长期进化的原因,在哺乳动物中,Ci基因发生了扩增,存在三个同源基因GLI1、GLI12和GLI3; Hh基因也发生了扩增,存在三个同源基因Shh、Ihh和Dhh; Ptch扩增为两个同源基因Ptch1和Ptch2,以上结果说明家蚕中存在Hh信号通路。2. BmHh的亚细胞定位及BmCi核定位信号鉴定对BmHh基因的自我剪切位点进行分析,发现BmHh基因的自我剪切位点为185位的半胱氨酸,从昆虫到哺乳动物,Hh基因的自我剪切位点具有进化上高度的保守性。将BmHh基因的全长CDS与Dsred共同构建到瞬时表达载体,通过脂质体的方法对家蚕细胞系进行转染,72小时后通过qRT-PCR检测发现BmHh的表达量上调了100倍以上：荧光观察发现与空载相比,BmHh有大量的表达并分布于细胞质紧挨细胞核的位置。BmCi作为转录因子定位到细胞内,通过序列分析预测,发现BmCi中512-515这四个氨基酸位点为典型的核定位序列,将这一序列与DsRed共同构建到瞬时表达载体中进行融合表达,转染细胞后,发现DsRed能够定位到细胞核中,而突变了任意一个氨基酸后都使其失去了核定位信号能力,DsRed定位于细胞质中,结果说明512-515的四个氨基酸为BmCi核定位信号。3. BmHh、BmPtch、BmSmo和BmCi的表达特征分析提取中肠发育各时期和5龄3天家蚕各组织RNA,通过RT-PCR技术,分别分析了BmHh、BmPtch、BmSmo和BmCi在家蚕中肠发育不同时期的和5龄3天不同组织中的时期表达特征。结果显示,在家蚕中肠发育的不同时期表达量不同,具有一定的时期表达特征。在各个龄期眠前和眠期,BmHh、BmPtch和BmCi表达量有明显的上调,BmSmo的表达变化不太显著。在5龄3天家蚕幼虫各组织中,BmHh、BmSmo、BmPtch和BmCi在家蚕各组织中都有表达,在不同的组织中其表达量有差异,如在精巢和血液中与其他组织相比表达量较低。4.病原体及抑制剂对Hh信号的诱导(1)对家蚕进行喂食大肠杆菌,通过qRT-PCR检测BmHh基因在大肠杆菌诱导后家蚕幼虫中肠的表达情况。结果显示,在添食大肠杆菌3-9h后,BmHh在家蚕中的表达有明显的上调,与对照组相比具有显著性差异。随着时间的推移,在12h之后BmHh的表达与对照组趋于一致。对家蚕喂食苏云金芽胞杆菌后,也诱导了家蚕中肠BmHh表达量上调,与大肠杆菌诱导后不同,在3h和9h后,BmHh表达量虽然上调,但其表达量与大肠杆菌组相比较低,在12h后BmHh表达量仍然上调,且显著高于对照组。推测BmHh参与了肠道损伤后应答,BmHh信号可能参与肠干细胞的增殖与分化,参与肠道损伤后的修复。(2)小分子化合物Cyclopamine是Hh信号的抑制剂,能够与Smo结合抑制Hh信号的转导。对家蚕注射一定剂量的环耙明抑制剂后qRT-PCR检测发现,在3-9h,家蚕中肠中的BmHh和BmPtch表达量显著下调,BmCi的表达量在3h后有所增加后,在6-9h有显著的降低。而BmSmo表达在6h和9h有所降低。说明Cyclopamine在家蚕中肠中也能够起到抑制Hh信号的作用。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-13
第一章文献综述  13-29
  1.1 干细胞概述  13-14
    1.1.1 干细胞的发现  13
    1.1.2 干细胞的特征及分类  13-14
    1.1.3 干细胞与微环境  14
  1.2 Hedgehog信号通路概述  14-18
    1.2.1 Hedgehog的发现  14-15
    1.2.2 Hedgehog信号通路的组成  15-17
    1.2.3 Hedgehog信号通路的转导  17-18
  1.3 昆虫中肠概述  18-24
    1.3.1 昆虫中肠的结构  18-21
    1.3.2 果蝇中肠的发育  21
    1.3.3 果蝇中肠细胞类型与增殖  21-23
    1.3.4 肠干细胞的标记  23-24
  1.4 Hh信号与干细胞  24-27
    1.4.1 Hh信号与组织修复  24-25
    1.4.2 Hh信号与肠道发育  25-26
    1.4.3 其他信号通路与中肠干细胞  26-27
  1.5 家蚕中肠干细胞研究概况与展望  27-29
第二章引言  29-31
  2.1 研究背景及意义  29-30
  2.2 主要研究内容  30
  2.3 研究技术路线  30-31
第三章家蚕Hedgehog信号通路相关基因的克隆及鉴定  31-55
  3.1 实验材料与试剂  31-34
    3.1.1 实验材料  31
    3.1.2 实验仪器  31-32
    3.1.3 主要试剂  32
    3.1.4 主要溶液及配制  32-34
  3.2 实验方法与步骤  34-41
    3.2.1 基因的同源性分析  34
    3.2.2 家蚕Hh同源基因的克隆及序列分析  34-40
    3.2.3 家蚕Hh通路相关基因序列的结构分析  40-41
  3.3 结果与分析  41-52
    3.3.1 家蚕Hh通路相关基因的基因组鉴定  41
    3.3.2 家蚕Hh通路相关基因的扩增  41-43
    3.3.3 家蚕Hh通路相关基因的的RACE扩增  43-45
    3.3.4 家蚕Hh通路相关基因的结构分析  45-47
    3.3.5 家蚕Hh通路相关基因的蛋白结构  47-52
  3.4 讨论  52-55
第四章 BmHh亚细胞定位及BmCi核定位信号鉴定  55-69
  4.1 主要材料与方法  55-56
    4.1.1 实验材料  55
    4.1.2 主要仪器  55
    4.1.3 主要药品  55
    4.1.4 主要溶液的配制  55-56
  4.2 实验方法  56-58
    4.2.1 BmHh基因ORF的克隆  56-57
    4.2.2 表达载体的构建  57-58
    4.2.3 细胞的瞬时转染  58
  4.3 结果与分析  58-67
    4.3.1 BmHh的亚细胞定位分析  58-63
    4.3.2 BmCi的核定位序列鉴定  63-67
  4.4 讨论  67-69
第五章家蚕BmHh基因的功能分析  69-81
  5.1 实验材料与试剂  69-70
    5.1.1 实验材料  69
    5.1.2 主要仪器  69-70
    5.1.3 主要药品  70
    5.1.4 主要试剂的配制  70
  5.2 实验方法  70-73
    5.2.1 基因的表达特征分析  70-71
    5.2.2 添食微生物  71-72
    5.2.3 注射Hh通路抑制剂  72-73
  5.3 实验结果与分析  73-78
    5.3.1 家蚕Hh通路相关基因的时期表达谱分析  73-75
    5.3.2 病原体对BmHh信号的诱导分析  75
    5.3.3 苏云金芽胞杆菌对家蚕中肠BmHh基因的诱导表达  75-76
    5.3.4 抑制剂对家蚕Hh通路的影响  76-78
  5.4 讨论  78-81
第六章全文总结  81-83
  6.1 家蚕Hh信号通路相关基因的鉴定、克隆及分析  81
  6.2 BmHh及BmCi的亚细胞定位分析  81
  6.3 BmHh、BmSmo、BmPtch和BmCi的表达特征分析  81
  6.4 微生物及环耙明对Hh信号的诱导  81-83
参考文献  83-89
附录  89-97
参加过的研究课题及发表论文目录一览表  97-99
致谢  99

家蚕Hedgehog信号通路相关基因的克隆、鉴定及其功能分析

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