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脂多糖结合蛋白（LBP）与过氧化物酶-4（Prx4）相互作用的研究

作　者: 吴琼
导　师: 马立新
学　校: 湖北大学
专　业: 遗传学
关键词: Toll样受体 Toll样受体4 LBP Prx4 炎症反应
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

Toll样受体(TLRs)是一类进化上高度保守的分子,最早发现其与果蝇胚胎背、腹侧的发育有关。这些受体在识别微生物组分和激活先天免疫细胞中起着重要的作用。随后,TLRs的同源蛋白也在哺乳动物的免疫细胞中被发现,称为TLR受体家族。Toll样受体4(TLR4)是介导内毒素/脂多糖(LPS)应答的主要受体,TLR4/CD14信号通路是介导内毒素诱导炎性反应的重要通路。脂多糖结合蛋白(LBP)可催化LPS转移到膜结合CD14(mCD14)的结合位点,再呈递给细胞LPS受体的一部分,从而形成LPS-LBP-mCD14复合物。该复合物通过TLR4-MD2-MyD88通路激活NF-KB,从而介导分泌前炎症因子基因的激活,引起前炎症因子TNF-a等的释放,触发全身炎症反应综合症。此外,LBP还催化LPS转移给可溶性CD14(sCD14),激活内皮细胞、上皮细胞等不含mCD14的细胞,产生一系列生物学效应。过氧化物酶-4(Prx4)在胞外空间通过清除ROS发挥抗氧化功能,存在于细胞质中的Prx4是H2O2介导的NF-KB信号激活的调节因子,Prx4依赖硫氧还蛋白还原H202,从而抑制H2O2介导的NF-KB信号的激活。同时,存在于胞外空间的Prx4也可以作为胞外因子激活NF-KB。本实验室前期工作通过酵母双杂交技术,以TLRs信号途径相关蛋白为诱饵,成人肝cDNA文库基因编码的蛋白为猎物,总共筛选到了近500对人类肝脏蛋白质相互作用,LBP/Prx4是其中的一对,此相互作用目前尚未见报道。由于这两种蛋白质在许多信号通路中起着很重要的,并且常以复合物的形式发挥重要的生理功能,所以我们推测在生理条件下这两个蛋白质之间的相互作用可能是真实的。为了证实这一对相互作用的真实性,我们应用蛋白质相互作用研究的常规技术,如GST pull-down技术、荧光共定位技术和免疫共沉淀技术研究这一对相互作用。GST pull-down实验和免疫共沉淀实验结果呈阳性,荧光共定位结果显示LBP与Prx4共定位于细胞质中。在今后的工作中,我们计划利用离体结合实验验证LBP与Prx4的结形式是氧化态,还是还原态,为研究其生理功能奠定基础。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一部分文献综述  12-26
  1.1 TLR信号通路  12-16
    1.1.1 TLR受体与哺乳动物天然免疫  12-13
    1.1.2 TLR受体与信号通路  13-14
    1.1.3 TLR4受体的配体与TLR4信号通路  14-16
  1.2 NF-κB信号概述  16-19
    1.2.1 NF-κB简介  16
    1.2.2 NF-κB信号通路  16-18
    1.2.3 NF-κB信号与人类疾病  18-19
  1.3 脂多糖结合蛋白(LBP)研究背景  19-22
    1.3.1 脂多糖结合蛋白(LBP)的分布和空间结构  19-20
    1.3.2 LBP的功能  20-22
  1.4 过氧化物酶-4(Peroxiredoxin4,Prx-4)的研究背景  22-24
    1.4.1 Peroxiredoxin(Prx)家族  22-23
    1.4.2 Prx4的分布和空间结构  23-24
    1.4.3 Prx4的功能  24
  1.5 本论文研究的目的和意义  24-26
第二部分材料与方法  26-50
  2.1 材料  26-32
    2.1.1 菌株,细胞系和质粒  26-28
    2.1.2 引物  28
    2.1.3 培养基  28-29
    2.1.4 试剂  29-30
    2.1.5 主要缓冲液  30-32
    2.1.6 仪器和设备  32
  2.2 方法  32-50
    2.2.1 琼脂糖凝胶回收目的DNA片段  32-33
    2.2.2 SDS碱裂解法制备质粒DNA  33-37
    2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备  37-38
    2.2.4 大肠杆菌的常规转化  38-39
    2.2.5 MAGIC克隆方法快速构建重组杆状病毒载体  39-40
    2.2.6 昆虫细胞Sf9的传代与培养  40
    2.2.7昆虫细胞Sf9的冻存与活化  40-41
    2.2.8 昆虫细胞Sf9的转染及杆状病毒粒子的收集与扩增  41
    2.2.9 目的蛋白在杆状病毒-昆虫细胞Sf9中的表达  41-42
    2.2.10 哺乳动物细胞HEK293T细胞的传代和培养  42
    2.2.11 哺乳动物细胞HEK293T细胞的冻存  42-43
    2.2.12 哺乳动物细胞HEK293T冻存细胞的活化  43
    2.2.13 哺乳动物细胞的转染  43
    2.2.14 SDS-PAGE检测蛋白质的表达  43-45
    2.2.15 免疫印记检测表达蛋白  45-46
    2.2.16 GST-pull down技术  46-48
    2.2.17 免疫共沉淀技术  48
    2.2.18 间接免疫焚光共定位技术  48-50
第三部分结果与分析  50-63
  3.1 TLRs信号途径相关蛋白相互作用候选蛋白的筛选  50
  3.2 基于杆状病毒-昆虫表达系统的GST pull-down表达载体的构建  50-58
    3.2.1 供体质粒pMAGIC-HIS-LBP和pMAGIC-GST-LBP的构建  50-52
    3.2.2 供体质粒pMAGIC-HIS-Prx4和pMAGIC-GST-Prx4的构建  52-54
    3.2.3 利用接合转移(MAGIC)快速构建重组杆状病毒载体  54-58
  3.3 LBP和Prx4在昆虫细胞Sf9中的表达  58-59
  3.4 GST pull-down实验离体证实LBP与Prx4间的相互作用  59-60
  3.5 免疫共沉淀实验证明LBP与Prx4间的相互作用  60-61
  3.6 LBP与Prx4共定位于细胞质中  61-62
  3.7 Prx4在昆虫细胞Sf9中的大量表达和纯化  62-63
第四部分讨论与展望  63-67
  4.1 讨论  63-65
  4.2 展望  65-67
参考文献  67-78
硕士期间科研成果  78-79
致谢  79

脂多糖结合蛋白（LBP）与过氧化物酶-4（Prx4）相互作用的研究

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