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EV71 3C蛋白酶及其与抗病毒药物相互作用的结构生物学研究

作 者: 王静
导 师: 金奇; 崔胜
学 校: 北京协和医学院
专 业: 微生物学
关键词: 小RNA3C蛋白酶 手足口病 糜蛋白酶相似性折叠 rupintrivir β折叠环 催化三联体 X射线衍射晶体学
分类号: R373.25
类 型: 博士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


人肠道病毒71型(human enterovirus71, EV71)是1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出来的。不同亚型感染后临床症状不完全相同,通常导致手足口病(hand foot and mouth disease, HFMD).重症手足口病可导致无菌性脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎样麻痹等多种与神经系统相关的疾病,致残及病死率较高。自1974年首次报道以来,EV71已在世界范围内引起十多次爆发与流行。在我国,手足口病曾经在南方许多省市发生过数次大规模流行,成为严重威胁人民健康的重大传染病之一,目前尚无有效的药物和疫苗。我国研究人员病毒基因工程国家重点实验室金奇教授等在1998年率先测定了EV71的基因全序列。EV71是小RNA病毒科,肠道病毒属成员。病毒基因组为约7500个核苷酸的单股正链RNA,基因组中仅有一个开放阅读框,编码约2200个氨基酸的无生物活性的EV71多聚蛋白前体(polyprotein)。该多聚蛋白需进一步被剪切,产生成熟的病毒结构蛋白和非结构蛋白。这些过程主要依赖于EV713C蛋白酶。EV713C蛋白酶不但可以对病毒前体蛋白进行剪切,还可以降解宿主蛋白,如多聚腺嘌呤核苷酸修饰调控蛋白(cleavage stimulation factor-64, CstF-64),从而干扰宿主mRNA合成。最近的研究表明EV713C能够通过结合视黄酸诱导基因-1(retinoid acid-inducible gene I, RIG-I)受体从而干扰RIG-I类解旋酶引发的天然免疫应答。除了蛋白酶功能以外,EV713C还具有识别病毒基因组RNA5’-非翻译区(untranslated regions, UTR)的活性,暗示了EV713C可能参与病毒RNA基因组复制的过程。基于EV713C在病毒生命周期和病毒宿主相互作用过程中的重要功能,该蛋白被认为是抗病毒药物设计的重要靶点之一。由于EV713C蛋白酶尚无结构信息,极大地限制了结构导向性EV713C蛋白酶抑制剂的研究。本研究首次解析了高分辨率(1.0A)的EV713C蛋白及其与rupintrivir(AG7088,芦平曲韦)形成复合物的晶体结构。结构分析表明,EV713C的基本结构与其它小RNA病毒3C蛋白酶相似,具有丝氨酸蛋白酶家族的典型折叠。我们发现:EV713C蛋白酶的β折叠环维持了罕见的开放构象,而这一重要的结构元件在其他结构已知的3C蛋白酶中维持闭合构象。通过结构比对分析,我们发现了两个位于β折叠环底部的保守氨基酸Gly123和His133,可起到铰链作用,从而控制β折叠环的构象变化。通过点突变实验我们证明了两个铰链氨基酸肽键的灵活性在EV713C蛋白酶底物识别和底物水解中起到重要作用。Rupintrivir是通过模拟肽底物设计的一种抗人鼻病毒(human rhinovirus, HRV)3C蛋白酶的抑制剂,最近研究证明它也能有效抑制一些肠道病毒。我们发现rupintrivir可以有效抑制EV71病毒(BJ/CHN/2008)复制,并在体外抑制EV713C的蛋白酶活性。为了阐明rupintrivir抗EV71的分子机制,我们进行了EV713C蛋白酶/rupintrivir共结晶实验获得了高分辨率的复合物晶体结构。结构分析表明,rupintrivir不可逆的结合在EV713C蛋白酶底物识别口袋中,其结合模式大体类似于rupintrivir与HRV3C的相互作用。Rupintrivir的C端部分不能稳定的结合在EV713C蛋白酶的离去集团口袋中。通过EV713C/rupintrivir复合物分子表面绘图发现EV713C蛋白酶底物识别区中存在一个凹陷的S2’口袋。类似的结构特征不存在于HRV3C蛋白酶结构中,但是存在于柯萨奇病毒(coxsackievirus B, CVB)3C蛋白酶和脊髓灰质炎病毒(poliovirus, PV)3C蛋白酶结构中。结合点突变实验我们证明了Glu71对于保持具有催化活性的His40的有效性构象具有不可替代的作用,从而进一步支持这类蛋白酶具有催化三联体的蛋白酶水解机制的假说。我们的实验数据还揭示了一个以往没有描述过的保守氨基酸Arg39在EV713C蛋白酶催化过程中可起“中和净带电性”的作用,它通过减弱Glu71的静负电性协助His40的去质子化过程。

全文目录


目录  4-5
摘要  5-7
Abstract  7-9
引言  9-27
  1 EV71病毒概述  9-13
  2 3C蛋白酶结构和功能的研究进展  13-20
  3 3C蛋白酶抑制剂的研究进展  20-27
第一节 EV71 3C蛋白酶的结构生物学研究  27-60
  前言  27-29
  材料和方法  29-40
  实验结果  40-50
  讨论  50-59
  结论  59-60
第二节 EV71 3C蛋白酶与rupintrivir复合物的结构生物学研究  60-81
  前言  60-61
  材料方法  61-65
  实验结果  65-71
  讨论  71-80
  结论  80-81
参考文献  81-92
附录一 英文缩写  92-95
附录二 在学期间发表的学术论文  95-96
致谢  96

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