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催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究

作　者: 赵杨
导　师: 牟颖; 吕绍武
学　校: 吉林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: GPx GST 单链抗体模拟酶催化三联体
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是众所周知的硒蛋白酶，在生物体内有重要的抗氧化功能，它可以催化还原机体内过多的ROS，使机体免受损伤。由于天然酶来源有制、价格昂贵、稳定性不好、分子量大等缺点限制了它们的实际应用，因此制备高活性的抗氧化酶模拟物具有重要意义。抗体酶技术是产生具有高活力GPx模拟物的有效方法。与全抗相比，通过一个连接肽（Linker）将重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）相连接构成的单链抗体Fv段（scFv），其大小为完整抗体分子的1/6，有较强的组织穿透力，因此更具有药用价值。天然GPx的活性中心中含有一个催化三联体结构（即催化模块），它由Sec，Gln和Trp构成，并且这个催化三联体结构是发挥抗氧化活性所必须的。为了模拟出抗体GPx酶，本研究在具有GST活性的单链抗体内引入了与天然GPx相似的催化模块结构。我们以生物信息学理论预测为基础，将scFv-2F3中的52位Ser、29位Phe、72位Val分别突变成Cyc52、Trp29、Gln72，成功构建了与天然GPx催化模块相近的结构，该结构的一级氨基酸序列为Trp29(W),Cys52(C),和Gln72(Q)。我们首先用直接突变技术在单链抗体scFv-2F3中引入催化模块Trp29(W), Cys52(C)和Gln72(Q)得到scFv-2F3-29W52C72Q，然后用大肠杆菌硒代半胱氨酸缺陷表达系统引入GPx的催化氨基酸Sec(U)并表达含硒蛋白，最后用镍亲和层析系统纯化出催化模块组装的含硒单链抗体。为了研究催化模块中不同氨基酸对酶活性影响，我们用直接突变技术获得了几种不同的突变体scFv-2F3-29F52C72V、 scFv-2F3-29W52C72V、 scFv-2F3-29F52C72Q，scFv-2F3-29W52S72Q。通过酶学性质研究表明，引入催化模块后scFv-2F3-29W52U72Q不具有的GST虽然没有活性，但是没有改变52位Ser的突变体对几种特异性底物却显示出GST活性，并与scFv-2F3相比有所提高，它的CDNB是43.9U/μmol，对硝基溴苯是150.54U/μmol，利尿酸是5.02U/μmol。研究显示引入催化三联体的scFv-2F3-29W52C72Q的GPx活性是4235U/μmol，接近天然酶GPx的活性。其他突变体scFv-2F3-29F52U72V、scFv-2F3-29W52U72V、scFv-2F3-29F52U72Q虽显示出GPx的活性，但是都比scFv-2F3-29W52C72Q的低。进一步通过稳态动力学研究表明，scFv-2F3-29W52U72Q的最适温度与最适平pH值都依赖它的GPx活性同样接近天然GPx值，并且GPx催化机制是乒乓机制，因此由催化三联体组成的催化模块对提高GPx活性和稳定性有重要意义。

全文目录

英文缩写词表  4-8
第一章绪论  8-23
  1.1 谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GPx)  9-14
    1.1.1 GPX 的分类  9-10
    1.1.2 GPx 的结构  10-12
    1.1.3 GPx 的催化机制  12-14
  1.2 谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferases, GST)  14-15
    1.2.1 GST 的结构  14-15
    1.2.2 GST 的生物学作用  15
  1.3 抗体酶  15-17
    1.3.1 抗体酶的概述  15-16
    1.3.2 抗体酶的制备  16-17
  1.4 GPX 的人工模拟  17-21
    1.4.1 GPx 人工模拟的研究概况  17-18
    1.4.2 含硒抗体模拟 GPx  18
    1.4.3 含硒单链抗体模拟 GPx  18-21
  1.5 基于同源模建的蛋白质结构预测  21
  1.6 蛋白质的模块组装  21-22
  1.7 立题依据及研究策略  22-23
第二章催化模块组装含硒单链抗体表达载体的构建  23-31
  2.1 实验仪器与材料  23-24
    2.1.1 菌株与质粒  23
    2.1.2 主要试剂  23
    2.1.3 主要仪器  23-24
  2.2 实验方法  24-28
    2.2.1 单链抗体 scFv-2F3 三维结构的同源模建  24
    2.2.2 提取模板质粒  24-25
    2.2.3 目的基因的定点突变  25-26
    2.2.4 Quik Change Site-Directed Mutagenesis PCR  26-27
    2.2.5 突变体的筛选  27-28
    2.2.6 阳性突变产物及菌种的保存  28
    2.2.7 阳性突变产物的鉴定  28
  2.3 实验结果与讨论  28-30
    2.3.1 单链抗体 scFv-2F3 同源模建结果分析  28-29
    2.3.2 突变载体测序结果  29-30
  2.4 本章小结  30-31
第三章催化模块组装含硒单链抗体的表达、纯化  31-44
  3.1 单链抗体及突变体的表达  31-37
    3.1.1 实验仪器与材料  31-33
    3.1.2 实验方法  33-37
  3.2 突变体的纯化  37-38
  3.3 实验结果与讨论  38-43
    3.3.1 突变体的表达  38-41
    3.3.2 突变体的纯化  41-43
  3.4 本章小结  43-44
第四章催化模块组装含硒单链抗体的活性研究  44-53
  4.1 实验仪器与材料  44-45
    4.1.1 主要试剂  44
    4.1.2 主要仪器  44-45
  4.2 实验方法  45-47
    4.2.1 蛋白含量的测定  45
    4.2.2 GST 活力的测定  45
    4.2.3 GPx 活力的测定  45-46
    4.2.4 scFv-2F3-52U29W72Q 的 GSH 结合常数测定  46
    4.2.5 scFv-2F3-52U29W72Q 最适温度和最适 pH 值  46-47
    4.2.6 scFv-2F3-52U29W72Q 的稳态动力学  47
  4.3 结果与讨论  47-52
    4.3.1 GST 活力  47-48
    4.3.2 GPx 活性分析  48-52
  4.4 本章小结  52-53
参考文献  53-64
致谢  64-66
中文摘要  66-68
Abstract  68-69

催化模块组装含硒单链抗体模拟GPx及活性研究

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