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CUEDC2在细胞有丝分裂期的功能研究

作　者: 李腾
导　师: 张学敏
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 细胞生物学
关键词: CUEDC2 纺锤体组装检查点后期促进复合体染色体不稳定性有丝分裂
分类号: Q253
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细胞的有丝分裂是一个复杂、精巧的调控过程,它使携带遗传信息的染色体一代代地以相同的数目传递下去,通过把染色体平均分配到两个子细胞从而维持了遗传的稳定性。为保证遗传信息的平均分配,每一个姐妹染色体对上的着丝粒都需要与分别来自两极的微管结合并建立拉力,此过程由有丝分裂中的纺锤体组装检查点(SAC)实时监控。纺锤体组装检查点可通过抑制APC/C的活性,来阻断securin与cyclin B1的降解从而延迟姐妹染色体的分离及后期的开始。具体来讲,纺锤体检查点调控的激活机制是将真核细胞阻滞在有丝分裂的中期直到所有的姐妹染色体对应的着丝粒与来自于相反两侧纺锤体极的微管相附着。细胞在由前中期到中期过程中,当着丝粒未与微管结合时,Mad2,Cdc20, Bub3及BubR1蛋白分子在着丝粒上形成有丝分裂检查点复合体(MCC)复合物,导致纺锤体组装检查点(SAC)信号的激活。MCC通过与E3泛素连接酶复合体APC/C的结合,从而阻断其泛素化降解有丝分裂底物cyclin B1以及securin。在此状态下有丝分裂的结束以及姐妹染色体的分离被抑制。而一旦着丝粒与来自于两极的微管建立完全连接,MCC就会与APC/C解离,SAC的抑制信号就被解除。此时APC/C的活性得以释放,并导致cyclin B1与securin的泛素化降解,进而导致姐妹染色体的分离及后期的开始。虽然对于有丝分裂的激活机制研究较为清楚,但其灭活过程至今依然不够明确。我们的研究提示磷酸化的CUEDC2很可能通过与Cdc20的直接结合,促进了Mad2与Cdc20解离的有丝分裂灭活过程,从而调节有丝分裂中期到后期的转化。本项研究中,我们首先发现在细胞中加入nocodazole及taxol进行有丝分裂阻滞后CUEDC2的条带发生明显的上移,而后我们分别在其他三种细胞系中也验证了此现象。为了确认其是否发生磷酸化的修饰,我们向有丝分裂期的裂解液中加入λ-PPase处理后,其可以完全逆转CUEDC2在有丝分裂期的条带翻转。进而我们利用质谱鉴定得到在CUEDC2的Ser110存在一个磷酸化位点,与我们之前的假设相一致。当我们构建了S110A的磷酸化灭活突变体后,发现其只以非磷酸化形式的下面条带存在,即使将细胞同步化的有丝分裂期也不能使其发生上移。为了探求CUEDC2在有丝分裂期的上游激酶,我们通过双thymidine阻滞释放发现细胞进入有丝分裂期时,Cdc27与CUEDC2的磷酸化条带上移时程相似,并且通过生物信息学预测推测CUEDC2的上游激酶为Cdk1。为了验证我们的假设,我们在细胞中外源转染Cdk1及cyclin B1可以使CUECD2发生条带的反转。并且当加入Cdk1特异性抑制剂RO3306后,发现其可将有丝分裂期裂解液孵育后上移的CUEDC2条带发生逆转。以上结果阐明Cdk1是CUEDC2的上游激酶。为了研究CUEDC2磷酸化在有丝分裂进程中的作用,我们采用Time Lapse动态观察干涉CUEDC2后的HeLa细胞有丝分裂的进程,发现大部分细胞出现中期延迟的现象,而对前中期的时间没有影响。之后在人视网膜上皮细胞(RPE)细胞中同样验证了此发现。为了排除off-target现象,我们用不同的siRNA干涉序列也验证了上述发现,并且中期延迟的时间与siRNA的干涉效果是一致的。为了进一步排除off-target现象并研究CUEDC2的磷酸化修饰在此过程的作用,通过在CUEDC2干涉的细胞中我们瞬时转染可以抵制干涉的CUEDC2 (WT)及CUEDC2 (S110A),发现只有存在磷酸化位点修饰的CUEDC2 (WT)可以逆转CUEDC2干涉造成的延迟,而CUEDC2 (S110A)则不可以,以上发现说明CUEDC2的磷酸化修饰对有丝分裂中期到后期的转化起着重要的调控作用。进而我们为了研究CUEDC2的作用机制,发现将CUEDC2干涉后并不影响纺锤体的形成以及形态,通过测量内着丝粒的距离以及对中期BubR1光强的定量发现CUEDC2干涉后也不影响着丝粒的内张力。进而通过Time Lapse动态观察Mad2蛋白在有丝分裂期的动态定位以及对前中期Mad2定位及光强的定量,排除了CUEDC2对微管与着丝粒之间附着的影响。通过免疫荧光我们对CUEDC2在有丝分裂期的定位进行研究发现其在胞浆成弥散状分布。以上数据都说明CUEDC2并不参与纺锤体检查点的激活过程。进一步我们研究CUEDC2是否参与纺锤体检查点的灭活过程,我们首先发现CUEDC2发挥功能是依赖于Mad2的,进而我们在体内与体外通过免疫共沉淀的方法发现只有CUEDC2 (WT)与Cdc20存在直接的相互作用,而CUEDC2 (S110A)则没有,且Mad2与CUEDC2 (WT)也不存在直接的相互作用,这为CUEDC2发挥功能提供了一定的分子基础。而后将CUEDC2过表达,发现细胞可越过taxol对细胞的有丝分裂阻滞作用并产生类似于间期的多核,而CUEDC2 (S110A)则没有此作用。我们在正常的乳腺上皮细胞中(MCF-10A)也重复了此发现。在正常的细胞进程中过表达CUEDC2 (WT)也可使有丝分裂后期染色体分离滞后的比例明显增加,而CUEDC2 (S110A)同样没有此作用。以上发现均证明了CUEDC2参与纺锤体的灭活过程,因为CUEDC2过表达可以导致纺锤体检查点的提前灭活以及后期的提前开始,并伴随着染色体的分离滞后的比例的增加,从而导致染色体不稳定(CIN)的产生。以上均提示CUEDC2可能与肿瘤的发生发展密切相关。为了研究其在肿瘤发生中的角色,我们对多种人体肿瘤的组织进行免疫组化染色发现,与正常组织相比,在人肾癌、卵巢癌组织中CUEDC2的表达量呈显著性的升高,均提示高表达的CUEDC2可能通过对纺锤体检查点灭活过程的异常调控促进肿瘤的发生和发展。非整倍体(Aneuploidy)与染色体的不稳定性(CIN)都是肿瘤的标志性特征。大多数实体肿瘤染色体都是非整倍体,并且许多染色体经常错误分离,这种表型可产生染色体的不稳定性(CIN),CIN与肿瘤病人的预后密切相关。我们发现当CUEDC2过表达可导致纺锤体检查点的调控异常,细胞可越过taxol对细胞的有丝分裂阻滞作用并产生类似于间期的多核,并且CUEDC2过表达也可明显增加有丝分裂后期染色体的分离滞后的比例,从而导致染色体不稳定的产生。综上所述我们的研究不仅证明磷酸化的CUEDC2可参与有丝分裂中期到后期的转化,还证明了其参与SAC的调控,并导致染色体的不稳定性的产生。由于高表达量的CUEDC2可能通过导致染色体的不稳定性从而促进肿瘤的发生,因此本研究不但提示CUEDC2可能参与到了肿瘤的发生发展的调控过程,也为肿瘤的治疗提供了新的线索。

CUEDC2在细胞有丝分裂期的功能研究

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