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靶向端粒G四重折叠结构的抗癌策略的研究

作　者: 陈昌岳
导　师: 谭铮
学　校: 武汉大学
专　业: 生物化学
关键词: 端粒端粒酶 G四重折叠结构稳定抑制醌甲基光诱导偶联序列导向烷基化
分类号: Q26
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

真核生物的染色体末端(端粒),是一个蛋白质-DNA复合物,它能保护染色体末端使之避免末端融合和末端降解。而端粒3’未端是一段富含TTAGGG的重复序列,它能折叠成G-quadruplex四重折叠结构并抑制端粒酶活性。端粒长度的动态平衡是癌症细胞无限增值的先决条件。在超过85%的癌症细胞中,端粒长度的动态平衡是被端粒酶维持的。在另外15%癌症细胞中,还存在以链交换(ALT)为基础的其他端粒延伸途径。Hurley实验组在1999年报道称在TS-TRAP中K+的浓度增加会导致端粒酶活性的降低,这和早期一些与G-quadruplex有相互作用的小分子如TMPYP4,BSU-1051在端粒酶延伸中的表现相似。从那以后,人们就把小分子在TS-TRAP中的ICso和它们稳定G-quadruplex的能力建立了联系。我选择了四个有报道的与G-quadruplex结合的小分子BMVC、Zn-TTAPc、 TSPc和Cu-TSPc,用一种野生型(WT)和两种突变型的端粒酶(CAC和CUA)一起延伸TS底物,先后在传统的TS-TRAP和我首创的单管双色TRAP方法来考察究竟在小分子抑制端粒酶延伸过程中有多少是通过小分子稳定G四重折叠结构来达到抑制效果的。实验结果和预期不符,我发现这些所谓的G4配体是通过多种抑制途径抑制端粒酶介导的端粒延伸的,这其中通过稳定端粒G四重折叠结构来抑制端粒延伸只占整个抑制贡献中极少一部分。而我通常用的那三种方法产生的抑制根本不是由于小分子稳定端粒G-quadruplex对端粒酶延伸抑制造成的。这个结论说明以前用小分子在端粒酶直接延伸、TS-TRAP和TSG4-TRAP的抑制IC50来评价小分子在端粒酶延伸过程中稳定G-quadruplex的能力是不准确的。这一结论说明小分子稳定G-quadruplex途径的抗癌机制还有待研究,同时单管双色TRAP也可以作为体外研究小分子在抑制端粒酶延伸机制中特异性和非特异性作用的系统。bisQMP是周翔实验室合成的一个水溶性好的光诱导的小分子交联剂,bisQMP是醌的前体,在>400nm的可见光下可以光诱导产生甲基中间体(o-QM), bisQMP I由于其亲电性可以进攻核酸和蛋白质上的亲核基团,是一种潜在的核酸烷基化试剂。为了进一步提高bisQMP的特异靶向性,我将bisQMP和一段寡核苷酸通过化学偶联反应得到一个序列导向性的光交联寡核苷酸探针,靶点是染色体末端端粒序列。在体外我分别用的电泳实验和PCR阻滞实验显示了这个光交联的寡核苷酸探针优秀的序列靶向性。我预期将它导入Hela细胞后这个探针能和端粒序列在光诱导下以共价键结合,光加合物结合端粒区或悬突区会阻止端粒的复制或端粒酶介导的端粒延伸,这样会导致端粒的快速损耗,最终导致细胞的凋亡。但接着的Annexin V-FITC染色的细胞凋亡实验却显示这个序列导向性探针和对照组随机链的探针相比却没有额外的显著抑制。这种结果可能由于这个光交联的寡核苷酸探针在细胞中与细胞组分非特异性作用,由于因素复杂,目前实验仍在进行中。

全文目录

论文创新点  5-6
中文摘要  6-7
Abstract  7-11
第一章背景介绍  11-44
  1 端粒生物学概述  11-24
    1.1 端粒与端粒DNA的高级结构  11-14
    1.2 端粒酶  14-17
    1.3 端粒酶延伸与端粒维持  17-24
  2 与端粒和端粒酶有关的抗癌策略  24-28
    2.1 直接靶向端粒和端粒酶的抗癌策略  24-27
    2.2 不靶向端粒酶但与端粒和端粒酶相关的其它端粒酶抑制途径  27-28
  3 小分子的G-quadruplex识别  28-42
    3.1 G-quadruplex的结构多样性  28-31
    3.2 小分子稳定端粒G-quadruplex的结构特征  31-35
    3.3 G-quadruplex小分子的生物学研究现状  35-42
  4. 本研究的目的及意义  42-44
第二章本领域的实验技术  44-67
  1 引言  44
  2 原子分析Atomic Resolution  44-46
    2.1 X-ray晶体衍射法(X-ray)  44-45
    2.2 核磁共振(NMR)  45-46
  3 热力学方法Thermodynamic Methods  46-49
    3.1 UV-Melting实验  46-48
    3.2 荧光共振能量转移实验FRET-Melting  48-49
  4 光谱学方法Spectroscopy  49-55
    4.1 圆二色光谱学实验Circular dichroism(CD)  49-51
    4.2 表面等离子共振Surface plasmon resonance(SPR)  51-53
    4.3 光谱学滴定实验Spectroscopic Titration  53-55
  5 硫酸二甲酯甲基化保护实验Dimethyl sulfate(DMS)footprinting  55-56
  6 酶学方法Enzymatic Methods  56-65
    6.1 聚合酶阻滞实验Polymerase stop assay  56-57
    6.2 PCR阻滞实验PCR stop assay  57-58
    6.3 端粒酶延伸Telomerase elongation  58-65
  7 非变性丙烯酰胺凝胶电泳Native-PAGE  65-66
  8 其他方法  66-67
第三章小分子稳定端粒的G-quadruplex结构在整个端粒酶延伸抑制中的贡献  67-93
  1 引言  67
  2 材料与方法  67-77
    2.1 实验材料和仪器  67-70
    2.2 实验方法  70-77
  3 实验结果  77-91
    3.1 使用野生型和突变性的端粒酶用传统的TS-TRAP难以检测到小分子对端粒G-quadruplex特异性的抑制  77-80
    3.2 滴定实验检测小分子与G-quadruplex的亲和能力  80-82
    3.3 在TRAP体系中使用dGTP和7一去氮-dGTP难以检测到端粒G-quadruplex依赖的抑制效应  82-84
    3.4 单管双色TRAP(ST/TC-TRAP)  84-87
    3.5 端粒G-quadruplex稳定在整个配体介导的端粒酶抑制中所占比重  87-91
  4 实验讨论  91-93
第四章光交联寡核苷酸探针的性质及应用  93-110
  1 引言  93
  2 材料与方法  93-100
    2.1 实验材料和仪器  93-95
    2.2 实验方法  95-100
  3 实验结果  100-108
    3.1 bisQMP-T1探针的制备  100-101
    3.2 序列导向的bisQMP和光诱导对于光交联产物的形成是必要的  101-103
    3.3 bisQMP与DNA的光交联产物完全抑制聚合酶扩增  103-104
    3.4 bisQMP-ODN1与bisQMP-ODN2的光照时间与光交联率的关系  104-105
    3.5 细胞对荧光标记的寡核苷酸的摄取  105
    3.6 Hela细胞双胸苷阻断法同步化  105-107
    3.7 Annexin V-FITC染色  107-108
  4 实验讨论  108-110
参考文献  110-127
博士读研期间发表的论文  127-128
致谢  128

靶向端粒G四重折叠结构的抗癌策略的研究

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