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登革2型病毒基因组3’非编码区对翻译的调控作用

作　者: 尉雁
导　师: 秦鄂德
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 登革2型病毒 3′非编码区 VIRG 脱氧核酶翻译调控
分类号: R373
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

登革病毒(DEN)为黄病毒科黄病毒属(Flavivirus)的重要成员,包括4个血清型,可引起人类登革热(DF)、登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)。其基因组为长约11kb的单股正链RNA,包括5′非编码区(untranslated region,UTR)、单一开放读码框(ORF)和3′非编码区。其ORF编码3种结构蛋白(C, prM和E)和7种非结构蛋白(NS)。5′和3′非编码区分别长约100与450个碱基,包括调控病毒复制与翻译的几个保守序列元件和二级结构。3′非编码区依次包含5个RNA元件(5′→3′):可变区(VR)、串联的重复保守序列(RCS)2、保守序列CS2、CS1和茎环结构SL。病毒基因组复制与翻译是病毒增殖的关键阶段,目前对于黄病毒复制与翻译的确切机制仍不清楚。登革病毒非编码区在病毒的复制和翻译中起重要作用,尤其是3′非编码区既可以起始RNA复制,又参与病毒的翻译。因此,探讨登革病毒3′非编码区在复制与翻译中的确切机制对于阐明病毒的致病机理具有重要意义。为此,本研究在分析登革病毒基因组结构的基础上,选择3′非编码区的保守序列和二级结构为研究对象,通过构建病毒诱导的报告基因系统(VIRG)及可裂解RNA的脱氧核酶(DRz),探讨3′非编码区不同序列及不同RNA元件对病毒翻译的可能调控机制,为深入研究登革病毒致病机理奠定基础。研究内容主要包括以下三个部分。一、登革2型病毒基因组非编码区诱导的报告基因系统(VIRG)的构建及鉴定为了构建研究登革病毒3′非编码区调控翻译的表达系统,我们将登革2型病毒非编码区与荧光素酶基因相连构建病毒诱导的报告基因(VIRG)。根据萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶具有不同的化学结构和底物要求及相同的反应条件,本研究分别将其与登革病毒非编码区相连,经体外转录、转染BHK-21细胞等操作过程,在同一样品中同时测定两个报告基因,以其中一个作为内对照,从而使检测结果避免了每次实验操作间的误差带来的干扰。在BHK细胞表达的报告基因,经WB分析具有萤火虫荧光素酶表达的特异性,与荧光素酶的活性检测的结果表明,本研究构建的萤火虫荧光素酶报告基因及内对照系统可在BHK细胞进行高效、稳定表达,实验具有良好的重复性,为下一步探讨3′非编码区翻译效率提供了平台。二、登革2型病毒基因组3′非编码区对翻译的调控作用利用VIRG系统,我们确定了登革病毒3′非编码区中RCS2-CS2对翻译的促进、CS1-SL序列对翻译的抑制作用。完全缺失3′非编码区的报告基因v-3′ΔUTR,几乎检测不到VIRG的翻译信号,说明3′非编码区序列参与了报告基因的翻译调控。含有3′非编码区VR序列而缺失其余序列的VIRG(v-VR,与含有全长3′非编码区的VIRG(v-3′UTR)翻译效率一致,表明VR序列对于报告基因的翻译具有重要作用。由于登革病毒3′末端不含多聚腺苷酸尾,我们设计了含有poly(A)尾的报告基因,发现VR序列与其翻译效率相似。说明VR序列可能具有与poly(A)相似的作用,增加mRNA稳定性或促进核糖体定位。另外,可与5′非编码区序列互补发生环化的CS1-SL序列比重复保守序列RCS2-CS2的翻译效率降低,说明对于基因组复制至关重要的环化序列并非翻译所必需的,而且mRNA环化可能阻止了5′末端与核糖体结合,降低了翻译效率。为了进一步探讨登革病毒3′非编码区不同长度序列对翻译的作用,我们设计筛选出5个在细胞外可裂解3′非编码区RNA的脱氧核酶(DRz),并对其中一个DRz15进行特异性分析。发现随时间延长,靶片段3′非编码区RNA逐渐减少而裂解产生的子片段逐渐增多,说明利用脱氧核酶可获得3′非编码区不同长度的序列。在此基础上,我们研究了在BHK细胞内脱氧核酶裂解报告基因产生含有3′非编码区不同长度序列的VIRG对翻译的影响,表明在细胞内利用脱氧核酶可获得含有不同长度3′非编码区的报告基因,为在细胞内登革2型病毒上研究其翻译调控提供了可能。最终,利用脱氧核酶在细胞内裂解登革病毒3′非编码区产生含有3′非编码区不同长度序列的登革病毒基因组,通过观察基因组翻译的结果,明确了其对病毒早期翻译的影响。这些结果表明登革病毒3′非编码区参与了翻译过程,而且CS1-SL序列起下调病毒翻译效率的作用。三、登革2型病毒3′非编码区不同元件对翻译的调控作用在3′非编码区不同长度序列对翻译具有调控作用的研究基础上,我们深入探讨了不同元件对翻译的影响。本研究通过构建含有3′非编码区不同单一元件的VIRG以及缺失不同元件的VIRG,发现RCS2、CS2元件具有上调报告基因翻译效率的作用,而CS1、SL元件具有下调作用。为了排除报告基因mRNA被降解所造成的差异,我们采用RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR分析了mRNA半衰期,结果表明翻译效率的差异与mRNA稳定性无关。对较为重要的SL元件,我们通过碱基突变破坏其二级茎环结构,构建了突变体与恢复突变体VIRG,发现SL对翻译效率起下调作用的关键是其与5′非编码区互补的碱基序列,而不是二级茎环结构。总之,在病毒非编码区诱导的报告基因VIRG基础上,我们首次系统地研究了登革2型病毒3′非编码区、不同长度序列及不同元件对翻译的调控作用。发现登革病毒3′非编码区参与了翻译调控, RCS2-CS2序列可提高翻译效率,而CS1-SL序列可抑制翻译;RCS2、CS2元件可上调翻译,CS1、SL元件可下调翻译;SL下调翻译的作用与其互补序列有关。这为阐明3′非编码区调控翻译的分子机制奠定了坚实的基础,对于研究登革病毒的致病机制具有重要意义。

全文目录

英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-16
第一部分登革2 型病毒诱导的报告基因的构建与鉴定  16-28
  1 材料和方法  16-20
  2 结果  20-25
  3 讨论  25-28
第二部分登革2 型病毒基因组3′非编码区在病毒翻译中的调控作用  28-46
  1 材料和方法  28-36
  2 结果  36-43
  3 讨论  43-46
第三部分登革2型病毒基因组3′非编码区不同RNA元件在病毒翻译中的调控作用  46-62
  1 材料和方法  46-51
  2 结果  51-59
  3 讨论  59-62
总结  62-63
参考文献  63-67
博士期间撰写的论著  67-68
致谢  68

登革2型病毒基因组3’非编码区对翻译的调控作用

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