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磷酸钙生物陶瓷表面结构和性质与蛋白质特异性吸附

作　者: 朱向东
导　师: 张兴栋
学　校: 四川大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 磷酸钙生物陶瓷 表面结构 表面性质 蛋白吸附
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


生物材料植入体内后的初始事件是蛋白质在植入体表面的吸附，吸附的蛋白质对于随后的细胞行为以及植入体的最终效果起着十分重要的作用。磷酸钙生物材料具有与人体骨组织的无机成分相似的特点而被广泛用作骨修复替换材料，其优良的生物学性质已得到了充分的证实。因此磷酸钙生物材料的蛋白质吸附行为，尤其是对骨相关蛋白质的特异性吸附是目前生物材料科学基础研究的前沿课题，对于揭示磷酸钙生物材料生物活性本质和骨诱导机理具有非常重要的意义。由于以往的研究大多集中在单一的羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）上，而且普遍使用的是体外单一蛋白体系，对于不同组成和结构的磷酸钙生物材料蛋白吸附的机理认识不充分，尤其是不同蛋白质之间的竞争吸附本质及其与材料本身的化学性质和结构的内在联系方面没有给出确切的信息。因此本文从单蛋白、双蛋白和血清蛋白吸附以及体内扩散盒植入出发，系统地研究不同组成和结构的磷酸钙陶瓷的体内外蛋白吸附行为，初步探讨了磷酸钙陶瓷蛋白吸附的机理，揭示了不同组成和结构磷酸钙陶瓷在蛋白吸附行为的相似性和相异性。蛋白吸附行为由材料和蛋白质本身的性质所决定。材料表面电位、化学吸附位点、亲水性等表面化学性质是影响其表面蛋白质吸附的重要因素：蛋白质本身结构、表面电荷、分子结构稳定性、柔性等也是影响其在材料表面吸附的重要因素。由于磷酸钙陶瓷组成和结构及表面性质上的上的相似性，决定其具有相似的蛋白吸附行为。根据接触角和Zeta电位测试结果，磷酸钙陶瓷具有一定的表面疏水性，在生理pH条件下它们具有负的表面Zeta电位。光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析结果显示牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）吸附导致磷酸钙陶瓷颗粒表面Ca和P周围结合原子的键合情况发生了较为明显的改变，证实磷酸钙陶瓷的两种吸附位点（带正电的C点和带负电的P点）都与BSA的吸附有关。根据BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附结果，BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附都是一个非常快速的过程，可以用一级反应式来描述，同时还可以用Langmuir型吸附等温式来预测BSA在磷酸钙陶瓷表面的吸附行为。HA和双相磷酸钙（biphasic calcium phosphate，BCP）陶瓷颗粒在表面疏水性和Zeta电位上的差异是它们具有不同BSA吸附能力的主要原因。磷酸钙陶瓷颗粒表面的BSA饱和吸附量都远低于理论计算值，因而具有较低的表面蛋白覆盖率。BCP比HA有更小的表面Zeta电位绝对值而对BSA的吸附阻碍更小；同时BCP较强的表面疏水性可促使更多的BSA分子在BCP陶瓷颗粒表面吸附聚集。因此，BCP陶瓷比HA有更强的BSA吸附能力。材料表面的Zeta电位随溶液组成、pH值、离子强度等因素影响，并影响材料表面的蛋白吸附能力，二者的变化之间具有一定的相关性，可以通过磷酸钙陶瓷颗粒和BSA之间的静电作用来给予解释。根据不同溶液条件下磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位测试和BSA吸附实验结果，HA、BCP和β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）三种磷酸钙陶瓷的表面Zeta电位和BSA吸附量随溶液环境变化时都会产生相类似的变化规律。H+、OH-、PO43-和Ca2+是磷酸钙陶瓷的电势决定离子，溶液中pH值、PO43-和Ca2+浓度的变化决定磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的极性和绝对值的大小，同时对BSA吸附量也会产生较大的影响；Na+和Cl-虽然不是磷酸钙陶瓷的电势决定离子，但是其浓度变化引起溶液离子强度的改变也会在一定程度上影响磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位和BSA吸附，只不过这种影响要受到溶液中那些电势决定离子的制约。BSA和溶菌酶（lysozyme，LSZ）在HA、BCP和β-TCP三种磷酸钙陶瓷颗粒表面具有类似的竞争吸附行为，LSZ比BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面有更高的吸附率，磷酸钙陶瓷对LSZ表现出更高的吸附亲和性。由此可以预测体液中的那些骨生长因子如BMP-2和TGF-β1等尽管含量很低，但是磷酸钙陶瓷对它们高的吸附亲和性极有可能使它们在磷酸钙陶瓷表面吸附聚集，这无疑对磷酸钙陶瓷骨诱导机理的解释是一个很好的补充。无论是在PBS还是在SBF中，随BSA／LSZ双蛋白体系中BSA和LSZ的浓度比例的不同，BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面的竞争吸附过程有所差异。当体系中BSA和LSZ的浓度相当时，具有较低分子量的LSZ由于具有较大的扩散系数而先于BSA之前达到磷酸钙陶瓷颗粒表面并发生吸附，但是由于LSZ和BSA之间的静电吸引和磷酸钙陶瓷颗粒表面空余的吸附位点的存在，BSA仍然能够在表面吸附，只是吸附量较小。随着体系中BSA浓度比例的提高，磷酸钙陶瓷颗粒表面的初始蛋白吸附就逐渐变成以BSA吸附为主。但是由于高浓度条件下BSA分子的构象改变程度较小，使得BSA和磷酸钙陶瓷颗粒表面的相互作用变弱。而LSZ由于与磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附亲和性更强，随着时间的增长，先吸附的BSA分子就可能被后到达的LSZ所取代。因此，当体系中LSZ浓度一定的时候，LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附几乎不受不受溶液中BSA浓度变化的影响。由于LSZ与骨生长因子蛋白有类似的分子量大小和电性质，由此可以预测体液中的那些骨生长因子如BMP-2和TGF-β1等尽管含量很低，但是磷酸钙陶瓷对它们高的吸附亲和性极有可能使它们在磷酸钙陶瓷表面吸附聚集。陶瓷孔隙结构对于其表面蛋白吸附具有重要影响。对多蛋白吸附体系，陶瓷表面同时表现出多层蛋白吸附行为。根据体外血清浸泡和体内扩散盒植入条件下不同表面结构磷酸钙陶瓷的蛋白吸附结果，相对于比表面积而言，磷酸钙陶瓷的孔结构大小和孔隙率对于其蛋白吸附量有着很大的贡献，其多孔结构特征大大提升了磷酸钙陶瓷的蛋白吸附能力。在体外血清蛋白吸附条件下磷酸钙陶瓷表面的蛋白吸附并不是纯粹的单分子层蛋白吸附，而是表现出多层蛋白吸附行为。磷酸钙陶瓷不仅能够吸附血液和组织液中那些含量比较高的蛋白质，而且对于Fibeonectin和TGF-β1这些与成骨密切相关的功能蛋白质也表现出较强的吸附能力。通过DS-PAGE电泳分析、Fibeonectin的免疫印迹分析和TGF-β1的ELISA定量分析结果显示，在体内扩散盒植入条件下磷酸钙陶瓷能够富集TGF-β1等生长因子蛋白，它们的TGF-β1吸附量随着吸附时间的延长而有显著的提高。HA、BCP和β-TCP在吸附的TGF-β1量上存在一定的差异，β-TCP的相对吸附量低于HA和BCP。多孔的BCP陶瓷吸附TGF-β1的量最大，这可能是它比HA和β-TCP有更强骨诱导能力的一个重要原因。

全文目录


摘要  4-7
英文摘要  7-15
第一章 综述  15-47
  1.1 磷酸钙生物材料  16-19
    1.1.1 磷酸钙生物材料的种类及物理化学性质  16-17
    1.1.2 磷酸钙生物材料的生物学性质  17-19
      1.1.2.1 磷酸钙生物材料的生物相容性和生物活性  17
      1.1.2.2 磷酸钙生物材料的骨诱导性  17-19
  1.2 与骨形成有关的蛋白质  19-23
    1.2.1 纤维连接蛋白(Fibronectin)  19-20
    1.2.2 玻璃体结合蛋白(Vitronectin)  20-21
    1.2.3 骨生长因子(bone growth factors)  21-23
      1.2.3.1 转化生长因子-β(TGF-β)  22-23
      1.2.3.2 骨形态发生蛋白(BMPs)  23
  1.3 生物材料蛋白吸附研究进展  23-31
    1.3.1 蛋白质结构及性质与蛋白吸附  24-27
    1.3.2 生物材料表面特性与蛋白吸附  27-28
    1.3.3 蛋白吸附的研究方法  28-31
  1.4 磷酸钙生物材料与蛋白质相互作用研究现状  31-34
    1.4.1 磷酸钙生物材料表面的蛋白吸附  31-33
    1.4.2 蛋白吸附与表面类骨磷灰石层的形成  33-34
  1.5 本文研究的目的、内容和技术路线  34-36
    1.5.1 本文研究的目的和内容  34-35
    1.5.2 本文研究的技术路线  35-36
  参考文献  36-47
第二章 牛血清白蛋白在磷酸钙生物陶瓷表面的吸附行为  47-72
  2.1 引言  47-48
  2.2 材料和方法  48-53
    2.2.1 材料  48-49
      2.2.1.1 基底材料  48-49
      2.2.1.2 蛋白质  49
    2.2.2 蛋白吸附实验  49
      2.2.2.1 蛋白溶液的准备  49
      2.2.2.2 蛋白吸附实验  49
    2.2.3 测试方法  49-53
      2.2.3.1 X-射线衍射分析(X-ray diffraction analysis,XRD)  49-50
      2.2.3.2 扫描电镜分析(Scanning electron micrograph,SEM)  50
      2.2.3.3 接触角测量(Contact angle analysis)  50
      2.2.3.4 表面Zeta电位测试(Zeta potential analysis)  50-52
      2.2.3.5 光电子能谱分析(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)  52
      2.2.3.6 蛋白定量分析  52-53
  2.3 结果与讨论  53-67
    2.3.1 HA和BCP陶瓷的相成分和显微结构  53-55
    2.3.2 HA和BCP陶瓷的表面可湿性  55
    2.3.3 HA和BCP陶瓷的表面Zeta电位  55-56
    2.3.4 BSA在磷酸钙陶瓷颗粒表面的吸附动力学和吸附等温线  56-61
    2.3.5 吸附BSA的磷酸钙陶瓷颗粒的XPS分析  61-64
    2.3.6 BSA在磷酸钙陶瓷表面的吸附机理  64-66
    2.3.7 HA和BCP陶瓷的BSA吸附能力差异与其表面性质之间的关系  66-67
  2.4 本章小结  67-68
  参考文献  68-72
第三章 磷酸钙生物陶瓷的ZETA电位变化对白蛋白吸附的影响  72-92
  3.1 引言  72-73
  3.2 材料与方法  73-76
    3.2.1 实验材料  73-74
    3.2.2 实验方法  74-76
      3.2.2.1 磷酸钙陶瓷颗粒的制备  74
      3.2.2.2 实验用溶液的配制  74
      3.2.2.3 表面Zeta电位测试  74
      3.2.2.4 蛋白吸附实验  74-75
      3.2.2.5 蛋白定量分析  75-76
  3.3 实验结果与讨论  76-88
    3.3.1 不同溶液条件下磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位  76-83
      3.3.1.1 溶液pH值变化对磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的影响  76-78
      3.3.1.2 溶液中离子强度的变化对磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的影响  78-80
      3.3.1.3 溶液中PO_4~(3-)浓度的变化对磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的影响  80-82
      3.3.1.4 溶液中Ca~(2+)浓度的变化对磷酸钙陶瓷颗粒表面Zeta电位的影响  82-83
    3.3.2 不同溶液条件下磷酸钙陶瓷颗粒的BSA吸附行为  83-86
    3.3.3 静电力在磷酸钙陶瓷表面BSA吸附中的作用  86-88
  3.4 本章小结  88-89
  参考文献  89-92
第四章 白蛋白和溶菌酶在磷酸钙生物陶瓷表面的竞争吸附  92-115
  4.1 引言  92-93
  4.2 材料与方法  93-97
    4.2.1 磷酸钙陶瓷颗粒的制备  93
    4.2.2 实验用蛋白及其溶液的准备  93
    4.2.3 电泳用溶液及试剂  93-94
    4.2.4 蛋白吸附与脱附实验  94-95
    4.2.5 测试方法及设备  95-97
      4.2.5.1 磷酸钙陶瓷颗粒的表征  95-96
      4.2.5.2 蛋白质样品的分析  96-97
  4.3 实验结果  97-105
    4.3.1 磷酸钙陶瓷颗粒的相组成  97
    4.3.2 磷酸钙陶瓷颗粒的显微结构  97-99
    4.3.3 磷酸钙陶瓷颗粒的粒度分布  99
    4.3.4 磷酸钙陶瓷颗粒的比表面积  99-100
    4.3.5 磷酸钙陶瓷颗粒的表面Zeta电位  100
    4.3.6 BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒上的单蛋白吸跗行为  100-101
    4.3.7 BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒上的竞争吸附结果  101-105
      4.3.7.1 不同缓冲体系下BSA和LSZ在BCP陶瓷颗粒上的竞争吸附行为  103
      4.3.7.2 同种缓冲体系下BSA和LSZ在不同磷酸钙陶瓷颗粒上的竞争吸附  103-105
  4.4 讨论  105-110
    4.4.1 BSA和LSZ的空间结构和表面电荷分布  105-106
    4.4.2 BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面单蛋白吸附过程中的静电效应  106-107
    4.4.3 BSA和LSZ在磷酸钙陶瓷颗粒表面竞争吸附行为的解释  107-110
  4.5 本章小结  110-111
  参考文献  111-115
第五章 不同结构磷酸钙陶瓷体内外的蛋白质特异性吸附  115-144
  5.1 前言  115-116
  5.2 材料与方法  116-123
    5.2.1 不同表面结构的磷酸钙陶瓷块体的制备  116-117
    5.2.2 体外血清蛋白吸附实验  117-118
    5.2.3 体内蛋白吸附实验  118-119
    5.2.4 分析方法  119-123
  5.3 实验结果与讨论  123-139
    5.3.1 磷酸钙陶瓷片的XRD分析  123-124
    5.3.2 磷酸钙陶瓷片的比表面积  124-125
    5.3.3 磷酸钙陶瓷片的SEM形貌分析  125-130
    5.3.4 磷酸钙陶瓷体内外总蛋白吸附能力  130-132
    5.3.5 磷酸钙陶瓷体内外蛋白质的特异性吸附  132-139
  5.4 本章小结  139-140
  参考文献  140-144
第六章 全文总结  144-147
  6.1 本文研究内容及特点  144-146
    6.1.1 单蛋白体系下不同磷酸钙陶瓷的BSA吸附行为  144
    6.1.2 磷酸钙陶瓷表面Zeta电位对BSA吸附的影响  144-145
    6.1.3 磷酸钙陶瓷表面BSA和LSZ的竞争吸附行为  145
    6.1.4 不同结构磷酸钙陶瓷体内外的蛋白质特异性吸附  145-146
  6.2 本文研究的创新之处  146
  6.3 本文研究中存在的不足  146
  6.4 下一步的工作  146-147
致谢  147-148
在读期间发表的论文目录  148-149

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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