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转移抑制因子nm23-H1与Ras-to-MAPK通路支架蛋白KSR氨基端突变体相互作用的研究

作　者: 肖文
导　师: 周清华
学　校: 四川大学
专　业: 肿瘤学
关键词: nm23-H1 KSR MAPK通路 肺癌
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


背景与目的近半个世纪以来世界上许多国家和地区，肺癌的发病率和死亡率均持续上升，成为威胁人类生命健康最大的恶性肿瘤。侵袭转移是肺癌的恶性标志和特征，也是导致患者治疗失败和死亡的主要原因。肺癌侵袭转移是一个多基因和多步骤发展过程，可涉及细胞多个信号通路的改变，正是由于某些细胞信号传导通路中的关键基因结构或功能异常，激活或抑制了细胞中相关信号传导通路，导致了肺癌侵袭和转移表型的表达。nm23-H1是肺癌的转移抑制基因，在调节肺癌侵袭转移的过程中，对调控与“肺癌转移抑制级联”相关的一系列下游基因具有重要的作用。Ras-to-MAPK信号传导通路普遍存在，在许多生长和发育信号传递中起关键的作用，并且通过Ras激活一系列细胞质激酶Raf，MEK和MAPK并传递信号。在Ras-to-MAPK通路中Ras激酶抑制基因（KSR）是在1995年发现的一个新基因，其功能是作为支架蛋白为组装Ras下游关键信号形成多蛋白复合体提供一个可利用的磷酸化反应支架，从而加速MAPK通路的信号传导。周清华教授为首的课题组前期研究探讨了nm23-H1与KSR相互作用关系，发现nm23-H1磷酸化KSR和KSR氨基端，而不磷酸化其羧基端。证实nm23-H1具有组氨酸激酶活性，从而推测nm23-H1可通过改变支架蛋白KSR的磷酸化状态影响Ras-to-MAPK通路的信号传导。目前尚不能确定nm23-H1基因调控KSR的分子靶点，以及nm23-H1与突变后KSR相互作用对nm23-H1调控肺癌转移有何影响?因此通过应用基因重组技术构建不同KSR片断，研究不同KSR片断与nm23-H1蛋白相互作用关系；根据nm23-H1蛋白磷酸化KSR片断的位置不同，应用定点突变技术选择可能的KSR磷酸化位点，在已知KSR基因DNA序列中准确地取代该位点碱基获得突变体蛋白质，研究突变后KSR蛋白与nm23-H1蛋白相互作用关系，为进一步阐明“肺癌转移抑制级联”的分子机制提供理论基础和试验依据。材料与方法（1）．应用本实验室构建的pET28a-nm23-H1表达载体，表达nm23-H1蛋白，应用亲和层析的方法纯化蛋白，以及Western blot和放射自显影的方法研究nm23-H1蛋白的生物学活性；（2）．应用基因重组技术从pCMV-Tag2b-KSR载体上构建出pCMV-Tag2b-N-296-KSR真核表达载体，测序验证结果。将pCMV-Tag2b-KSR、pCMV-Tag2b-N-KSR，pCMV-Tag2b-N-296-KSR和pCMV-Tag2b-C-KSR四种真核表达载体转染293T细胞，获得KSR，N-KSR，N-296-KSR和C-KSR融合蛋白，可以通过Westernblot鉴定目的蛋白。体外激酶活性分析自磷酸化的nm23-H1蛋白与不同长度KSR、N-296-KSR，N-KSR和C-KSR之间磷酸化的关系；（3）．应用本实验室改进的定点突变技术分别构建了全长6950bp pCMV-Tag2b-KSR氨基端9个位点，并瞬时转染293T细胞株表达蛋白；（4）．应用亲和胶纯化KSR突变蛋白，应用体外激酶活性实验方法检测野生型自磷酸化nm23-H1与KSR突变体蛋白是否发生相互作用，从而寻找可能的nm23-H1磷酸化KSR位点。结果本研究观察到：（1）本研究成功将本实验室构建的pET28a-nm23-H1原核表达载体表达出了原核蛋白，应用亲和层析的方法纯化nm23-H1蛋白，用放射自显影的方法证实原核表达蛋白具有自身磷酸化生物学活性并且表达的目的蛋白能够通过Western blot鉴定。（2）本研究从pCMV-Tag2b-KSR载体上成功构建出pCMV-Tag2b-KSR-296片段真核表达载体；并成功地将其真核表达载体转染293T细胞，获得FLAG-N-KSR-296片段融合蛋白，目的蛋白可以通过Western blot鉴定。（3）体外激酶活性实验发现，自磷酸化的nm23-H1不能磷酸化N-296-KSR和羧基端，据此可以推测nm23-H1磷酸化KSR在N-296和N-538之间，这个位置主要集中在KSR的CA3、CA4区域之间。（4）本研究应用改良的QuikChangeTM方法进行定点突变，成功构建了9个突变型pCMV-Tag2b-KSR质粒：pCMV-Tag2b-KSRS297A、pCMV-Tag2b-KSRS392A、pCMV-Tag2b-KSRS431A、pCMV-Tag2b-KSRS434A、pCMV-Tag2b-KSRS435A、pCMV-Tag2b-KSRS438A、pCMV-Tag2b-KSRS439A、pCMV-Tag2bKSRS442A，pCMV-Tag2b-KSRS443A。经DNA测序证实。瞬时转染293T细胞转染出目的蛋白、纯化后并进行western blot检测鉴定。（5）体外激酶活性实验发现：自磷酸化的nm23-H1与KSR突变体蛋白发生作用，在FLAG-KSRS297A、FLAG-KSRS392A、FLAG-KSRS431A、FLAG-KSRS435A、FLAG-KSRS438A、FLAG-KSRS442A，FLAG-KSRS443A8个突变体放射自显影图中可见有磷酸化条带，而FLAG-KSRS439A突变蛋白没有出现磷酸化条带，FLAG-KSRS434A、FLAG-KSRS297A可以被磷酸化，但是磷酸化条带很弱，该结果说明发生突变的KSR丝氨酸297、392、431、435、438、442、443位点不是nm23-H1磷酸化位点，而丝氨酸439位点是nm23-H1磷酸化位点。结论（1）成功表达出具有活性的野生型nm23-H1蛋白；（2）成功构建pCMV-Tag2b-KSR-N-296片段真核表达载体，并获得该片段融合蛋白；（3）成功构建pCMV-Tag2b-KSR氨基端9个突变位点真核表达载体获得9个突变体蛋白：FLAG-KSRS297A、FLAG-KSRS392A、FLAG-KSRS431A、FLAG-KSRS434A、FLAG-KSRS435A、FLAG-KSRS438A、FLAG-KSRS439A、FLAG-KSRS442A，FLAG-KSRS443A；（4）证实自磷酸化的nm23-H1可以磷酸化KSR，它们之间存在磷酸化关系，在研究发现9个突变体蛋白中除KSRS439A未发生磷酸化以外，其它8个蛋白均发生了磷酸化反应，据此推测nm23-H1调控KSR的分子靶点可能位于KSR氨基端的丝氨酸439位点，nm23-H1可影响KSR磷酸化水平，nm23-H1抑制肺癌转移的机理可能与KSR的磷酸化功能状态有关。

全文目录


摘要  5-9
Abstract  9-14
前言  14-17
实验流程图  17-18
第一部分 野生型nm23-H1蛋白的原核表达及其生物学活性分析  18-55
  一 野生型nm23-H1蛋白质的原核表达  18-37
  二 野生型nm23-H1原核表达蛋白质生物学活性鉴定  37-55
    (一) Westernblot法检测蛋白表达  37-42
    (二) 放射性自显影法检测蛋白质的自身磷酸化活性  42-55
第二部分 构建pCMV-Tag2b-KSR-296片段真核表达载体及其活性检测  55-91
  一 构建pCMV-Tag2b-KSR-296片段真核表达体  55-67
  二 pCMV-Tag2b-KSR、pCMV-Tag2b-N-KSR、pCMV-Tag2b-N-296-KSR、pCMV-Tag2b-C-KSR瞬时转染293T细胞并Westernblot法检测蛋白表达  67-75
  三 体外激酶活性实验分析nm23-H1与KSR各突变体的磷酸化关系  75-91
第三部分 pCMV-Tag2b-KSR氨基端9个突变体的构建和及其活性检测  91-137
  一 应用定点突变技术构建pCMV-Tag2b-KSR氨基端9个突变体  91-118
  二 瞬时转染293T细胞并Westernblot法检测蛋白表达  118-137
第四部分 nm23-H1与KSR氨基端突变体相互作用关系的研究  137-153
  材料与方法  137-143
  结果  143-147
  讨论  147-153
全文总结  153-156
参考文献  156-167
综述  167-186
四川大学博士论文研究创新自我评述  186-188
个人简历  188-189
致谢  189

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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