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氯仿—甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的研制及其免疫保护性和安全性初步评价

作　者: 孙长俭
导　师: 温博海
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 微生物学
关键词: 贝氏柯克斯体 Q热疫苗体液免疫细胞免疫脂肪酸
分类号: R376
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii，又称Q热立克次体)为Q热病原体。该病原体为专性细胞内寄生菌，可通过气溶胶传播，对人和动物的感染性极强，是一种重要的生物战剂／生物恐怖剂。人、畜对贝氏柯克斯体普遍易感，畜牧相关从业人员是高危人群。不管是预防贝氏柯克斯体自然感染还是防生物武器／生物恐怖均需要有效的Q热疫苗对易感人群进行免疫接种。本研究将国内分离的贝氏柯克斯体新桥株在鸡胚大量繁殖，然后从感染鸡胚中分离、纯化贝氏柯克斯体，用甲醛灭活纯化贝氏柯克斯体，制备全细胞疫苗(WCV)，同时采用氯仿-甲醇提取WCV，制备氯仿-甲醇提取残存组分疫苗(CMR)。采用高压气相色谱测定了两种疫苗的脂肪酸，发现CMR较WCV减少了11种脂肪酸，其中4种为不饱和脂肪酸，4种为支链脂肪酸，70％为C原子数≥18的较长链的脂肪酸。另外，两种疫苗的支链脂肪酸与直链脂肪酸、不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值也明显不同。通过蛋白单相及双向电泳分析两种疫苗蛋白，它们的蛋白电泳图谱和主要高丰度蛋白点的蛋白丰度均无明显差异。采用CMR和WCV免疫BALB／c小鼠，间接免疫荧光法分析免疫小鼠血清特异性抗体水平，结果显示CMR与WCV一样均能诱导高水平特异性抗体产生。CMR加Al(OH)3佐剂免疫小鼠，该免疫小鼠特异性抗体水平显著高于CMR单独免疫。用MTT法体外分析免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖，结果显示CMR诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖水平显著高于WCV，而WCV对小鼠淋巴细胞增殖有一定程度的抑制。免疫小鼠体内、外细胞因子的测定结果显示，CMR疫苗能诱导TNF-α、IFN-γ及IL-10等多种细胞因子的分泌。用贝氏柯克斯体Ⅰ相强毒株(包括疫苗制备株和美国分离Nine Mile株和欧洲分离的Henzerling)攻击免疫小鼠，用荧光定量PCR分析小鼠脾脏贝氏柯克斯体的量。结果显示CMR与WCV一样能有效保护小鼠抵抗贝氏柯克斯体的攻击。CMR加Al(OH)3佐剂免疫小鼠的脾脏贝氏柯克斯体的量显著少于CMR单独免疫。用大剂量WCV免疫小鼠，在接种部位出现皮下结节，小鼠的脾脏明显肿大，组织病理学检查脾脏有不同程度的网状内皮细胞增生。检查免疫小鼠肝脏功能指标，ALT和AST均明显升高。而相同大剂量CMR免疫小鼠则无上述病理学变化和肝功能损伤。WCV疫苗是目前唯一得到美国FDA批准应用的Q热疫苗，虽然其具有良好的免疫保护效果，但其明显的副作用使得其应用受到严格限制。本研究证明采用国内分离株制备的CMR疫苗与WCV疫苗的免疫保护效果相当，但是CMR疫苗的副作用明显小于WCV，CMR疫苗的低毒性是由于氯仿-甲醇提取WCV后，清除引起机体损伤的某些脂类或显著降低某些脂类含量密切有关。CMR疫苗的良好免疫保护效果与其高效诱导机体的体液和细胞免疫应答相关。Q热疫苗免疫小鼠能部分对抗登革病毒的感染，显示其具有非特异免疫保护作用。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
第一部分氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)Q热疫苗的制备  11-33
  材料  12-14
  方法  14-22
  结果  22-31
  讨论  31-33
第二部分 CMR疫苗的免疫保护性评价  33-50
  材料  34-36
  方法  36-42
  结果  42-47
  讨论  47-50
第三部分 CMR疫苗的安全性评价  50-57
  材料  50-51
  方法  51-52
  结果  52-55
  讨论  55-57
第四部分 Q热疫苗抗登革病毒的非特异免疫保护作用  57-66
  材料  57-58
  方法  58-62
  结果  62-64
  讨论  64-66
小结  66-67
参考文献  67-72
附录1  72-73
附录2  73-80
致谢  80

氯仿—甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的研制及其免疫保护性和安全性初步评价

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