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软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除导致小鼠听力丧失和内耳发育畸形的相关研究

作　者: 侯昭晖
导　师: 杨伟炎；杨仕明
学　校: 中国人民解放军军医进修学院
专　业: 耳鼻咽喉—头颈外科
关键词: Smad4基因条件基因敲除感音神经性耳聋内耳发育耳蜗畸形
分类号: R764.43
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

TGF-β超家族成员包括TGF-β，ACTIVIN和BMP。它们对胚胎发育、器官形成、调节细胞生长、分化、凋亡和间质的合成等方面起重要作用，其信号转导需要TGF-β受体和Smads分子的参与。Smad4是Smads共用型分子，是转导TGF-β信号的重要胞浆内信号级联分子，它与活化的受体激活型Smad分子形成复合物，移位到细胞核，与其他转录因子协同作用，调节TGF-β应答基因的转录。Smad4功能失活或是表达低下可能影响TGF-β的信号转导。为了研究Smad4基因在内耳发育中的作用，利用Cre-LoxP系统形成软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠，绕过了应用完全基因敲除Smad4基因后导致小鼠在胚胎发育早期(e6.5)死亡的障碍。本研究通过听功能表型的观察和内耳形态学的多种方法对Smad4基因在内耳发育中的作用进行了初步研究。本研究包括以下三个部分。第一部分动物模型的鉴定和Smad4基因在小鼠耳蜗内的表达在应用该动物模型进行Smad4基因功能研究前，我们首先要确定该模型的可靠性和敲除基因的准确性。只有在确定动物模型成功建立后，才能够保证接下来的功能学和形态学研究最终结果的科学性。软骨细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠和ROSA26转基因小鼠交配，得到Cre和ROSA26双转基因小鼠。在双转基因小鼠中，Cre重组酶发挥作用会使来自ROSA26转基因小鼠的LacZ基因表达，通过LacZ染色观察LacZ基因表达的组织特异性来反映Cre重组酶表达的组织特异性。所有由软骨内成骨形成的骨骼，尤其是颞骨岩部LacZ染色阳性。这些证明了颞骨岩部表达Cre重组酶。应用Southern Blot技术来证明只有在软骨细胞内Smad4基因被特异性的剔除。免疫组织化学荧光显示在新生的Smad4+/+小鼠内耳软骨细胞内有强烈的萤光显色，而Smad4-/-小鼠内耳软骨细胞内没有检测到荧光信号。这证明了在小鼠内耳软骨细胞的确没有Smad4基因的表达，软骨细胞特异Smad4条件基因敲除小鼠动物模型成功建立。应用免疫组化我们来观察了三种基因型小鼠耳蜗膜迷路内Smad4基因的表达情况，结果显示Smad4基因在三种小鼠耳蜗感觉上皮内均有广泛表达，尤其是耳蜗毛细胞和血管纹。这些结果说明在软骨细胞剔除Smad4基因没有影响内耳感觉上皮中该基因的表达。第二部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠的听功能检测探究Smad4基因在内耳发育是否发挥作用，首先要了解动物模型的听力表型特征。在本研究中对软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠我们进行了听觉脑干反应(auditory brainstem response ABR)、耳蜗微音电位(cochlear microphonic CM)、听神经复合动作电位(compound action potential CAP)三种听功能检查。ABR检查结果显示，野生型和杂合型小鼠均可以引出稳定的、可辨别的、可重复的ABR波形。而所有纯合子小鼠在测试条件下100 dBSPL以下均无法引出可辨别的、可重复的ABR波形。进行统计学处理，野生型小鼠和杂合型小鼠ABR阈值和纯合型小鼠ABR阈值相比差异有统计学意义(p＜0.01)。CAP检查结果与ABR检查结果相似，纯合子小鼠的全频均未见听神经复合动作电位引出(click，0.5k，1k，4k，8k，16k，32k)。野生型和杂合型小鼠在测试条件下都可以引出稳定的、可辨别的神经复合动作电位波形。野生型、杂合型小鼠的CM波形可见波形幅值在给声强度增加时呈现饱和状态(非线性)，而纯合子小鼠的波形随着给声强度的增加呈现非饱和状态(线性)。三种听功能检查从不同角度评价了动物模型的听功能特征，ABR显示小鼠的整个听觉通路的某个部位或是某几个部位出现了Smad4基因缺陷导致的病理变化。CM结果证明小鼠模型的耳蜗的外毛细胞功能异常，耳蜗非线性调节功能丧失。CAP的结果证明小鼠模型的听神经放电同步化不良。综合以上结果，说明由于在软骨细胞中的Smad4基因的剔除，引起这种小鼠出现重度感音神经性耳聋。这种小鼠是听功能表型稳定的Smad4基因缺陷耳聋动物模型。第三部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠耳蜗的形态学观察在了解到这种耳聋动物模型听力表型特征之后，就要进行形态学的相关研究来获得引起这种表型变化的形态学和病理学相关信息。在这一部分中，我们应用了多种研究手段来详细评价动物模型耳蜗内的结构变化。将三种基因型小鼠的内耳取出后在显微镜下比较，可见Smad4-/-小鼠的内耳较Smad4+/+和Smad4+/-体积明显减小，而且在大体形态上呈现出耳蜗蜗尖的骨性凹陷。将三种基因型小鼠的中耳听小骨在显微镜下解剖出来后进行细微的比较，发现Smad4-/-小鼠和Smad4+/-小鼠的砧骨发育畸形。内耳标本环氧树脂包埋后半薄连续切片观察。观察到Smad4-/-小鼠耳蜗形态异常，骨螺旋板发育异常。无论是骨螺旋板的螺旋角度还是基底膜的螺旋角度均与Smad4+／+和Smad4+／-小鼠不同。测量相邻骨螺旋板的角度并经过统计学处理，显示纯合子组与其它两组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。我们对三种基因型小鼠连续切片观察了内外毛细胞、支持细胞、盖膜、螺旋韧带和血管纹的形态学特点。Smad4+／+和Smad4+／-小鼠内、外毛细胞形态正常，未见缺失；Smad4-／-小鼠的内、外毛细胞偶见点状缺失。盖膜、螺旋韧带未见明显的差异。但是值得注意的是，Smad4-／-小鼠的螺旋凸形态异常，与Smad4+／+和Smad4+／-小鼠相比较呈现明显的膨隆凸起。Smad4-／-小鼠耳蜗半薄切片螺旋神经节观察，螺旋神经节细胞胞核小，胞浆多，核与核之间间隙较大。而Smad4+／+小鼠螺旋神经节呈现正常的形态，核大，细胞间排列较紧密。对耳蜗连续切片的螺旋神经节细胞进行计数比较观察，三者螺旋神经节细胞数量差异无统计学意义(P＞0.05)。在扫描电镜观察中，Smad4+／+和Smad4+／-小鼠耳蜗各回的三排外毛细胞的纤毛发育正常，形态无异，排列有序。内毛细胞纤毛也呈现正常的形态特点。因为基因敲除后引起的耳蜗骨性发育畸形导致骨螺旋板和基底膜的形态异常，在对中回及底回的基底膜观察中我们无法从正常角度得到外毛细胞纤毛形态及排列特点的具体信息。但在此区域我们至少可以观察到内毛细胞静纤毛发育不良。在中回偏上区域，Smad4-／-小鼠内、外毛细胞的纤毛发育很差，并有静纤毛的融合、转位的出现，还可以观察到外毛细胞的点状缺失。因为Smad4-／-小鼠耳蜗骨螺旋板和基底膜的畸形，无法得到理想的角度进行扫描电镜下毛细胞的观察，我们利用全耳蜗基底膜铺片进行免疫染色观察毛细胞形态学并且对三种基因型小鼠的毛细胞进行计数比较。首先我们先进行了基底膜的Hoechst染色，显示毛细胞的细胞核。Smad4+／+小鼠内、外毛细胞均未见缺失，内、外毛细胞核排列整齐有序。Smad4+／-小鼠内、外毛细胞偶见缺失，内、外毛细胞核排列尚整齐。Smad4-／-小鼠内、外毛细胞均可见散在的点状的缺失，毛细胞排列紊乱失序。在此基础上我们又对内、外毛细胞进行了计数，三者的内、外毛细胞数量未见统计学差异(P＞0.05)。为了观察毛细胞的纤毛发育及排列情况，我们进行了Hoechst和Phalloidin双染。染色结果显示Smad4+／+和Smad4+／-小鼠内、外毛细胞纤毛形态正常，排列整齐；Smad4-／-小鼠内、外毛细胞发育不良，排列紊乱，而且由于基底膜畸形的缘故纤毛高低不一，相邻纤毛不在同一平面。全耳蜗铺片的MyosinⅥ和Neurofilament双染色可以显示毛细胞的胞体、神经突触以及与之相连的神经丝。Smad4-／-小鼠的内毛细胞除了表现出形态各异，排列紊乱以外，还表现出与之相连的神经突触膨大，排列不规则，神经纤维减少消失的特点。与之相反，Smad4+／+和Smad4+／-小鼠无论是细胞形态、神经突触形态及排列还是神经丝的形态数量都相对正常。对三种基因型小鼠耳蜗进行透射电镜观察，我们发现Smad4-／-小鼠外毛细胞突触末梢与另外两基因型相比，数量明显减少。在存在外毛细胞突触的情况下突触也明显较后两者小。Smad4-／-小鼠内毛细胞突触末梢与后两者相比，传入神经突触明显空泡化，与内毛细胞接触界限不清晰，神经纤维紊乱。形态学的结果显示软骨细胞内Smad4基因的异常引起小鼠耳蜗的各种病理变化，这些都证明了Smad4基因是内耳发育所必需的基因之一。Smad4基因的功能缺陷可以导致感音神经性耳聋，Smad4基因是一种耳聋相关基因。特异性地在软骨细胞内对Smad4基因进行敲除却引起耳蜗感觉细胞发育的异常，在动物模型上提供了遗传学证据证明了在胚胎发育的早期耳周间充质细胞与感觉上皮之间的确存在着重要的信号相互作用，这种信号相互作用不仅仅是内耳骨性包囊形成所必需，更是耳蜗内感觉上皮发育为成熟的感觉细胞所必需的。

全文目录

中英文缩略词表  7-8
中文摘要  8-12
英文摘要  12-17
前言  17-25
第一部分动物模型的鉴定和Smad4基因在小鼠耳蜗内的表达  25-41
  材料  25-26
  实验方法  26-31
  结果  31-36
  讨论  36-38
  小结  38
  参考文献  38-41
第二部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠的听功能检测  41-54
  材料  41-42
  实验方法  42-44
  结果  44-49
  讨论  49-52
  小结  52
  参考文献  52-54
第三部分软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除小鼠耳蜗的形态学观察  54-90
  材料  54-55
  实验方法  55-61
  结果  61-75
  讨论  75-83
  小结  83
  参考文献  83-90
论文结论及展望  90-92
  论文结论  90
  未来展望  90-92
文献综述一  92-100
文献综述二  100-113
攻读博士学位期间发表论文情况  113-114
致谢  114-115

软骨细胞特异性Smad4条件基因敲除导致小鼠听力丧失和内耳发育畸形的相关研究

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